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一 體外受精技術(shù) 體外受精方式主要包括常規(guī)體外受精（conventional in vitro fertilization，CIVF）技術(shù)和卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）技術(shù)，此外，有些IVF實(shí)驗(yàn)室目前也采用一種短時受精補(bǔ)救性ICSI（rescue-ICSI）體外受精技術(shù)。 1. CIVF技術(shù)：是將不孕癥夫婦的卵子與精子取出體外，在體外培養(yǎng)體系中受精并發(fā)育成胚胎的技術(shù)。CIVF操作是直接在培養(yǎng)卵冠丘復(fù)合體（oocyte corona cumulus complexes,OCCCs）的培養(yǎng)液內(nèi)加入優(yōu)選后的精子，使精卵結(jié)合發(fā)生受精，發(fā)育至胚胎。CIVF授精技術(shù)主要解決體內(nèi)精卵不能相遇問題，其臨床應(yīng)用價值在于解決女性因素不孕，針對以下患者實(shí)施CIVF技術(shù)：（1）排卵異�；颊撸喊á� 小卵泡排卵患者；② 優(yōu)勢卵泡不破裂，不能正常排卵的LUFS患者；③ 多囊卵巢綜合征患者；④ 卵巢功能儲備下降，需要進(jìn)行多次促排卵治療積攢胚胎進(jìn)行胚胎移植患者。（2）輸卵管因素不孕患者：以輸卵管造影及腹腔鏡檢查結(jié)果作為判斷輸卵管功能的標(biāo)準(zhǔn)，以下情況可考慮進(jìn)行IVF-ET治療：① 雙側(cè)輸卵管阻塞；② 輸卵管部分通暢；③ 輸卵管積水；④ 輸卵管與周圍組織粘連；⑤ 輸卵管結(jié)核；⑥ 輸卵管發(fā)育異常；⑦ 輸卵管切除。（3）子宮內(nèi)膜因素不孕患者：輕、中度子宮內(nèi)膜異位癥患者經(jīng)多次人工授精失敗，或重度子宮內(nèi)膜異位癥患者。（4）不明原因不孕患者。（5）免疫性不孕患者，包括臨床常見的抗精子抗體陽性、抗磷脂抗體陽性等患者。除女性因素不孕外，IVF-ET也被用來對少、弱精子癥經(jīng)多次人工授精失敗的不孕夫妻進(jìn)行助孕治療[5,6]。 2. ICSI技術(shù)：ICSI授精是CIVF授精技術(shù)的衍生和發(fā)展，是將精子通過顯微注射技術(shù)直接注入到卵胞質(zhì)內(nèi)，實(shí)現(xiàn)體外受精的目的。ICSI技術(shù)臨床應(yīng)用價值在于解決男方嚴(yán)重少精子癥、弱畸精癥、少弱畸精癥、梗阻性無精癥或睪丸發(fā)育不良、免疫性不孕、前次周期IVF受精失敗的患者，此外為避免精子DNA污染，ICSI也被應(yīng)用于需要進(jìn)行植入前胚胎遺傳學(xué)檢測（PGT）的患者卵子的體外受精[6,7]。 由于ICSI較IVF受精率高，可以得到更多胚胎以供移植時選擇，國外生殖中心采用ICSI方式進(jìn)行體外受精的比例逐年增加[8]。隨著對ICSI及輔助生育安全性認(rèn)識的提高，人們發(fā)現(xiàn)，ICSI可能較IVF更容易產(chǎn)生出生缺陷，尿道下裂、多指（趾）或并指（趾）的新生兒缺陷在ICSI患者中比例明顯增高；ICSI過程中，對配子過多的體外操作是否會提高印跡基因疾病發(fā)生風(fēng)險，也日益引起人們關(guān)注；此外對于那些因Y染色體AZF區(qū)基因微缺失引起的無精或少精癥患者，ICSI技術(shù)幫助他們解決不孕癥煩惱的同時，也將Y染色體遺傳缺陷帶給了他們的男性后代。研究證實(shí)，對于非男性因素導(dǎo)致不孕的患者，ICSI與IVF相比，并沒有改善受精后的妊娠結(jié)局，而相同周期ICSI費(fèi)用比IVF高，因此，臨床工作中嚴(yán)格把握ICSI治療指征非常必要[9]。 3. Half-ICSI和Rescue-ICSI技術(shù)：Half-ICSI授精技術(shù)即將半數(shù)卵子進(jìn)行IVF常規(guī)授精，半數(shù)卵子進(jìn)行ICSI授精；Rescue-ICSI授精技術(shù)是我國學(xué)者創(chuàng)建并在全國普遍開展起來的體外授精方法，在加精后5小時左右，剝除OCCCs周圍的顆粒細(xì)胞，觀察卵母細(xì)胞第二極體排出情況，以確保卵子受精。 這兩種受精方式是傳統(tǒng)的IVF和ICSI的衍生技術(shù)，主要目的是避免體外受精失敗發(fā)生。有8%左右的CIVF周期會發(fā)生受精失敗和低受精率[9]，完全受精失敗可能導(dǎo)致治療周期無可移植胚胎；而ICSI雖然可保證卵子獲得更高的受精機(jī)會，但由于ICSI技術(shù)涉及更多的生殖安全性、執(zhí)行成本和病人就醫(yī)費(fèi)用高等問題，因此，我國中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會規(guī)范指南明確規(guī)定了ICSI授精的臨床指征[10]。為避免受精失敗給患者造成經(jīng)濟(jì)損失和精神損失，half-ICSI或者短時受精觀察補(bǔ)救性ICSI（rescue-ICSI）成為不明確授精方式情況下最常用的兩種替代授精方式[11-13]。但由于執(zhí)行成本增加，95%的half-ICSI患者為此增加了不必要的醫(yī)療花費(fèi)。短時受精觀察Rescue-ICSI技術(shù)能夠降低完全受精失敗發(fā)生，避免不必要的ICSI操作，減少患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，但該技術(shù)需要在加精后3-5h進(jìn)行第二極體觀察，實(shí)驗(yàn)室必須在此時進(jìn)行卵子顆粒細(xì)胞的剝除，同樣增加了卵子異常受精和卵子損傷的風(fēng)險，生殖安全性問題也一直受到業(yè)內(nèi)關(guān)注，而報道ICSI可能增加胚胎染色體異常幾率發(fā)生[14]。 此外，針對特殊小圓頭精子、來自睪丸的凍融精子在進(jìn)行ICSI后，建議采用人工卵母細(xì)胞激活術(shù)（artificial oocyte active，AOA），但AOA的臨床安全性尚無足夠證據(jù)證明，因此AOA應(yīng)在臨床上僅使用于特殊人群，并獲得患者知情同意[15,16]。 二 胚胎培養(yǎng)技術(shù) 1. 低氧培養(yǎng)技術(shù)的臨床應(yīng)用：即將培養(yǎng)箱內(nèi)氧濃度通過使用三氣培養(yǎng)箱，利用向培養(yǎng)箱內(nèi)補(bǔ)充高純氮?dú)馐古囵B(yǎng)箱內(nèi)氧濃度下降到5%或以下的培養(yǎng)方式。低氧濃度可使體外培養(yǎng)的胚胎更容易發(fā)育到囊胚，相關(guān)meta分析認(rèn)為，低氧濃度與出生率提高具有明顯的相關(guān)性。低氧濃度培養(yǎng)環(huán)境與胚胎發(fā)育的體內(nèi)環(huán)境相類似，同時低氧培養(yǎng)減少了ROS的產(chǎn)生，降低了胚胎的應(yīng)激反應(yīng)[17,18]。 2. 囊胚培養(yǎng)技術(shù)在臨床的應(yīng)用：隨著體外培養(yǎng)體系的發(fā)展和成熟，囊胚培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)越來越成為IVF實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的關(guān)鍵。囊胚培養(yǎng)的臨床意義在于：（1）更符合臨床生理。生理情況下，囊胚經(jīng)過5-6天的發(fā)育從輸卵管進(jìn)入子宮腔，開始發(fā)育并完成種植，因此囊胚移植更符合生理，相較于卵裂期胚胎移植可顯著提高臨床妊娠結(jié)局。（2）臨床采用單囊胚移植技術(shù)可有效避免多胎妊娠的發(fā)生，特別是針對二胎患者、宮頸機(jī)能不全患者、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者進(jìn)行單囊胚移植更具有孕期母胎安全的臨床意義。（3）囊胚培養(yǎng)可篩除染色體可能異常的胚胎，減少體外培養(yǎng)胚胎的儲存數(shù)量，縮短患者成功妊娠的病程[19]。 囊胚培養(yǎng)如果失敗，則無可移植胚胎風(fēng)險；而囊胚移植的男性嬰兒出生比例高也是臨床是否采用全部囊胚移植策略的一個影響因素。 3. 時差培養(yǎng)技術(shù)的臨床應(yīng)用：時差培養(yǎng)箱可以實(shí)時觀察胚胎培養(yǎng)情況，并通過定時連續(xù)的圖像采集功能，記錄胚胎發(fā)育全過程，無需將胚胎拿出培養(yǎng)箱外進(jìn)行胚胎形態(tài)學(xué)觀察即可得到胚胎發(fā)育的全部數(shù)據(jù)，胚胎培養(yǎng)更安全[20]。胚胎時差培養(yǎng)的臨床價值在于可實(shí)現(xiàn)受精捕捉，發(fā)現(xiàn)異常卵裂的胚胎，通過早期卵裂速度判斷胚胎發(fā)育潛能，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行單胚胎移植。研究證實(shí)通過對時差培養(yǎng)得到的胚胎發(fā)育情況數(shù)據(jù)分析和優(yōu)選后，單卵裂期胚胎移植的成功率明顯高于常規(guī)體外培養(yǎng)的卵裂期胚胎。這種對胚胎的優(yōu)選技術(shù)不僅在臨床結(jié)局上可獲得滿意的結(jié)果，同時也降低了胚胎在體外的培養(yǎng)時間，減少了培養(yǎng)環(huán)境因素可能引起的表觀遺傳學(xué)改變，同時避免因囊胚移植而造成的性別比例失調(diào)現(xiàn)象[21]。時差胚胎培養(yǎng)技術(shù)的臨床應(yīng)用還體現(xiàn)在海量圖片的記錄上，為將來IVF實(shí)驗(yàn)室發(fā)展人工智能技術(shù)，判斷胚胎發(fā)育潛能提供了大數(shù)據(jù)學(xué)習(xí)的影響資料和數(shù)據(jù)資料，利于后期機(jī)器學(xué)習(xí)、訓(xùn)練和結(jié)果驗(yàn)證，而智能化胚胎培養(yǎng)將是IVF實(shí)驗(yàn)室胚胎培養(yǎng)的未來趨勢[22]。 三 胚胎移植技術(shù)與胚胎評估和輔助孵化技術(shù) 四 配子和胚胎玻璃化凍融技術(shù) 胚胎冷凍技術(shù)現(xiàn)已成為IVF實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)常規(guī)。其臨床意義在于：① 增加IVF治療累積妊娠率；② 降低多胎妊娠風(fēng)險；③ 避免發(fā)生OHSS；④ 為因疾病、社會或心理因素?zé)o法進(jìn)行新鮮胚胎移植的病人保留繼續(xù)治療的機(jī)會；⑤ 有助于受卵病人的治療。隨著冷凍保護(hù)劑的改進(jìn)和玻璃化凍融技術(shù)的發(fā)展，卵子凍融成功率已經(jīng)得到顯著提高。卵子冷凍保存主要應(yīng)用于IVF實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取卵日無法獲得丈夫的精子情況，同時，卵子冷凍保存最大的臨床意義在于可以為腫瘤患者進(jìn)行生育力保存，以及捐贈卵子的卵子庫建立。 卵子冷凍保存技術(shù)從慢速冷凍發(fā)展至玻璃化冷凍，實(shí)現(xiàn)了質(zhì)的飛躍[24]。目前玻璃化凍存卵子用于腫瘤患者生育力保存越來越受到廣泛關(guān)注[25]。由于卵子體積大，胞質(zhì)內(nèi)含有大量的水分，卵膜滲透性差，含有大量膜性結(jié)構(gòu)細(xì)胞器，同時具有特殊的MII結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)內(nèi)紡錘體對溫度極敏感等獨(dú)特的形態(tài)和生理特性，使得卵子冷凍技術(shù)雖然能夠獲得滿意的復(fù)蘇率，但冷凍帶來的細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)的損傷可能導(dǎo)致卵子發(fā)育能力受到影響[26,27]，如何保證冷凍復(fù)蘇后的卵子具有生理活性，是目前需要解決的關(guān)鍵問題[28]。研究證實(shí)，通過改善冷凍保護(hù)劑內(nèi)血清濃度及各種氨基酸含量，可改善冷凍復(fù)蘇后的卵子發(fā)育潛能[29-31]，但尚缺乏臨床數(shù)據(jù)支撐。對于社會因素進(jìn)行的卵子冷凍保存技術(shù)，由于法律法規(guī)限制，同時卵子長期保存可能存在的生殖安全風(fēng)險的不確定性，目前在我國，仍禁止未婚健康育齡女性進(jìn)行卵子冷凍保存。 相比于卵子冷凍技術(shù)，精子冷凍保存技術(shù)相對完善，目前針對顯微外科取精技術(shù)發(fā)展起來的微量精子冷凍技術(shù)解決了無精子癥患者的不育問題。通過多次進(jìn)行顯微取精技術(shù)，獲得睪丸來源的精子，在顯微鏡下將每一個活動的精子收集起來，進(jìn)行冷凍保存，可以避免IVF實(shí)驗(yàn)室在取卵日無精子授精的情況發(fā)生，同時由于冷凍時精子是存活的，在解凍后，只要尾部不是僵硬的，即使不活動，依然可以放心用來進(jìn)行ICSI操作。微量精子冷凍技術(shù)為越來越多的無精子癥患者提供了可以獲得出生嬰兒的機(jī)會。 五 卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù) 六 植入前胚胎遺傳學(xué)檢測 胚胎植入前遺傳學(xué)檢測（preimplantation genetic testing，PGT）是在胚胎著床之前對配子或胚胎的遺傳物質(zhì)進(jìn)行分析,檢測配子或胚胎是否有遺傳物質(zhì)異常的一種早期產(chǎn)前診斷方法，經(jīng)過PGT篩選檢測項目正常的胚胎進(jìn)行移植，胚胎活檢細(xì)胞以囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢為趨勢。高通量分子遺傳學(xué)檢測技術(shù)的快速發(fā)展，極大提高了PGT診斷的準(zhǔn)確性和全面性，并且進(jìn)一步將PGT分為胚胎植入前非整倍性檢測（PGT for aneuploidies，PGT-A）；胚胎植入前染色體結(jié)構(gòu)變異檢測（PGT for chromosomal structural rearrangements，PGTSR）；胚胎植入前單基因病檢測（PGT for monogenic/single gene defects，PGT-M）三種技術(shù)。其中，PGT-A歸類為植入前遺傳學(xué)篩查（preimplantation genetic screening，PGS），而PGT-SR和PGT-M則歸類為胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）。 PGS的臨床應(yīng)用的循證證據(jù)尚需進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證，其指征也面臨修正和更新，目前PGS可應(yīng)用于以下幾個方面：女方高齡，女方年齡38歲及以上取卵患者；不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)2次及以上患者；不明原因反復(fù)種植失敗患者；嚴(yán)重畸形精子癥患者。 PGD技術(shù)的臨床意義在于篩查單基因遺傳性疾病。當(dāng)夫婦任一方或雙方攜帶染色體結(jié)構(gòu)異常，包括相互易位、羅氏易位、倒位、復(fù)雜易位、致病性微缺失或微重復(fù)時；當(dāng)具有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X連鎖隱性遺傳、X連鎖顯性遺傳、Y連鎖遺傳等遺傳病子代高風(fēng)險的夫婦，且家族中的致病基因突變診斷明確或致病基因連鎖標(biāo)記明確時；或者當(dāng)夫婦任一方或雙方攜帶有嚴(yán)重疾病的遺傳易感基因的致病突變患者時，可利用PGD技術(shù)篩選正常胚胎進(jìn)行移植，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育的臨床目的[37,38]。 綜述所述，IVF實(shí)驗(yàn)室技術(shù)始終貫穿整個IVF助孕治療的始終，合理正確使用IVF技術(shù)，將對改善不孕夫婦妊娠結(jié)局具有重要的臨床價值和社會意義。 參考文獻(xiàn)略 注：本文來源于《臨床實(shí)驗(yàn)室》雜志2020年第9期“生殖與女性健康”專題 |