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本文轉(zhuǎn)載自檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)網(wǎng) 作者：袁玉華 單位：天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院空港醫(yī)院檢驗(yàn)科 新型冠狀病毒（COVID-19）核酸檢測作為新冠病毒感染實(shí)驗(yàn)室檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程的質(zhì)量控制尤為重要，新冠病毒核酸檢測必須使用質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品，才能保證結(jié)果的可靠。 2020年11月5日國務(wù)院應(yīng)對新冠肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制醫(yī)療救治組《關(guān)于加強(qiáng)外送樣本新冠病毒核酸檢測質(zhì)量管理工作的通知》中進(jìn)一步明確：“每批次檢測時(shí)，應(yīng)當(dāng)隨機(jī)放入至少1份弱陽性（1.5-3倍檢測限）和3份陰性室內(nèi)質(zhì)控樣本，進(jìn)行質(zhì)量控制，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題，避免假陰性和假陽性”，進(jìn)一步強(qiáng)化了新冠核酸檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的要求。 新冠病毒的高致病性及不穩(wěn)定性，限制了患者陽性樣本作為天然質(zhì)控品及標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用，因此，一個(gè)穩(wěn)定可靠、且無生物傳染性的 RNA 質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品，對于保證新冠病毒的 RT-PCR檢測質(zhì)量具有重要意義。 在核酸檢測過程中，為保持與實(shí)際檢測樣品間擴(kuò)增效率的一致性，作為標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)盡量選擇與實(shí)際檢測樣品結(jié)構(gòu)近似的樣品。 鑒于目前COVID-19核酸檢測的國際標(biāo)準(zhǔn)或參考物質(zhì)尚未建立，WHO頒布的“Emergency Use listing（EUL）: Instructions for Submission Requirements: In vitro diagnostics (IVDs) Detecting SARS-CoV-2 Nucleic Acid”推薦可以使用體外轉(zhuǎn)錄RNA 或假病毒作為新冠病毒核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品。 假病毒是一類嵌合型病毒顆粒，通過基因工程手段構(gòu)建出含有目的核酸片段及包裝蛋白形成的復(fù)合體。1998年P(guān)asloske[1,2]等開始提出了裝甲RNA（armored RNA）技術(shù)，即由MS2噬菌體外殼蛋白包裹重組RNA的技術(shù)，這種假病毒無感染性，無自主復(fù)制能力，生物安全性高，核酸穩(wěn)定，不易降解。另外一種是慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建假病毒，將目標(biāo)基因克隆入慢病毒載體，與包裝質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞，包裝出假病毒，該技術(shù)制備的假病毒具有假病顆粒穩(wěn)定、安全，且可有效監(jiān)控RNA樣品核酸制備及RT‐PCR反應(yīng)中逆轉(zhuǎn)錄過程[3,4]。 由于新冠病毒是RNA包膜病毒，慢病毒載體包裝病毒無論在病毒直徑和病毒包膜的結(jié)構(gòu)上，都相對噬菌體更接近冠狀病毒的結(jié)構(gòu)，可以更真實(shí)地模擬臨床樣本，為多數(shù)質(zhì)控品生產(chǎn)廠商采用的新冠假病毒制備方法。 人工合成的假病毒耐核酸酶作用，穩(wěn)定性好，易保存和運(yùn)輸，能夠參與從樣品處理到擴(kuò)增的全程質(zhì)量監(jiān)測，即可作為室內(nèi)質(zhì)控品監(jiān)測實(shí)驗(yàn)精密度，也可定值后作為室間質(zhì)控品[5]。體外人工合成的新冠病毒基因組RNA（裸RNA）可作為新冠病毒標(biāo)準(zhǔn)品對相應(yīng)擴(kuò)增試劑進(jìn)行性能驗(yàn)證。 目前，假病毒質(zhì)控品已大規(guī)模應(yīng)用于新冠病毒核酸檢測實(shí)驗(yàn)室，但在選擇假病毒質(zhì)控品的時(shí)候仍需注意幾個(gè)問題： 1、實(shí)驗(yàn)室需明確所使用的假病毒質(zhì)控品包含RT-PCR擴(kuò)增試劑檢測的靶基因，因不同檢測方法學(xué)及試劑盒針對的基因及靶序列各異，推薦使用包含新冠病毒全基因組的質(zhì)控品，確保所使用的質(zhì)控品適用實(shí)驗(yàn)室所采納的檢測技術(shù)及試劑盒（截至6月12日，國家食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)42個(gè)新型冠狀病毒檢測試劑盒上市）。 2、關(guān)注假病毒質(zhì)控品的穩(wěn)定性，在試劑盒說明書建議的穩(wěn)定期內(nèi)使用，導(dǎo)致假病毒質(zhì)控品不穩(wěn)定的原因比較多，可能是假病毒包裹工藝不完善，也可能是生產(chǎn)質(zhì)控品流程的其他環(huán)節(jié)，建議在質(zhì)控品使用前做穩(wěn)定性驗(yàn)證。 3、假病毒質(zhì)控品DNA殘留問題，是假病毒生產(chǎn)過程中作為RNA轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒模板產(chǎn)生，制造商須優(yōu)化工藝，將質(zhì)粒DNA殘留減少至不影響RNA的檢測，因病毒RNA的檢測需經(jīng)過RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果樣本中有質(zhì)粒DNA殘留，也能直接通過PCR擴(kuò)增出來，另外DNA的穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于RNA，因此不能反映實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控過程的真實(shí)情況，建議在質(zhì)控品使用前做質(zhì)粒DNA殘留驗(yàn)證。 4、目前市場上的假病毒類質(zhì)控品多為非定值質(zhì)控品，如果用于對核酸提取效率進(jìn)行驗(yàn)證，需使用定值質(zhì)控品（可用數(shù)字PCR方法定值）[6]，擴(kuò)增試劑的驗(yàn)證必須使用RNA標(biāo)準(zhǔn)品。 【參考文獻(xiàn)】 1.Pasloske B L，Walkerpeach C R，Obermoeller R D，Winkler M，DuBois D B. Armored RNA technology forproduction of ribonuclease ⁃ resistant viral RNA controls and standards［J］. J Clin Microbiol，1998，36（12）：3590 ⁃3594. 2.WalkerPeach C R，Winkler M，DuBois D B，Pasloske B L. Ribonuclease ⁃ resistant RNA controls （Armored RNA） for reverse transcription ⁃ PCR，branched DNA， and genotyping assays for hepatitis C virus［J］. Clin Chem，1999，45（12）：2079⁃2085. 3.鄧俊花， 吳紹強(qiáng)，假病毒在RNA 核酸檢測中的質(zhì)控品應(yīng)用研究進(jìn)展，獸醫(yī)食品衛(wèi)生與檢驗(yàn)檢疫專題 T 04 0 05 9 4.Mattiuzzo G，Ashall J，Doris K S，MacLellan ⁃ Gibson K，Nicolson C，Wilkinson D E，Harvey R，Almond N，Anderson R， Efstathiou S， Minor P D， Page M. Development of lentivirus ⁃ based reference materials for Ebola virus nucleic acid amplification technology ⁃ based assays［J/OL］. PLoS One，2015，10（11）：e0142751. 5.歐陽艷艷 張永卓 高穎 隋志偉 戴新華，新冠假病毒核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制和應(yīng)用，中國計(jì)量，DOI:10.16569/j.cnki.cn11-3720/t.2020.11.033 6.D o n g L , Z h o u J , Ni u C, e t a l . H i g h l y accurate and sensitive diagnostic detection of SARSCoV- 2 by digital PCR. medRxiv 2020. https://doi.org/10.1101/2020.03.14.20036129 |