單位：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科子宮頸癌是女性最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性健康[1]。高危型人乳頭狀瘤病毒（high risk human papailloma virus，HR-HPV）持續(xù)性感染是子宮頸癌及癌前病變發(fā)生的主要病因，基于高危型HPV檢測(cè)是較為理想的宮頸癌篩查工具[2-3]。
目前，HPV核酸檢測(cè)已在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛開展，也常用于社區(qū)宮頸癌高危人群的篩查與分流。由于HPV檢測(cè)試劑種類眾多，某些實(shí)驗(yàn)室對(duì)HPV檢測(cè)技術(shù)的選擇仍存在困惑或選擇不恰當(dāng)，HPV檢測(cè)報(bào)告的結(jié)果解讀也存在爭(zhēng)議，為此，本文總結(jié)了HPV核酸檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀并剖析了不同種類HPV核酸檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用特點(diǎn)和應(yīng)用場(chǎng)景。
一、HPV核酸檢測(cè)技術(shù)的種類及檢測(cè)特點(diǎn)根據(jù)檢測(cè)原理不同，HPV核酸檢測(cè)技術(shù)可以歸為兩大類，即信號(hào)放大技術(shù)和靶標(biāo)擴(kuò)增技術(shù)。1.信號(hào)放大技術(shù)：信號(hào)放大技術(shù)是指HPV檢測(cè)中HPV的DNA未被擴(kuò)增，而是通過與HPV DNA結(jié)合的化學(xué)信號(hào)進(jìn)行放大的方法，這類HPV核酸檢測(cè)試劑主要包括第二代雜交捕獲法（hybrid capture 2，HC2）和care HPV技術(shù)以及Cervista TM HPV test和基于原位雜交法（in situ hybridization，ISH）的一些試劑。HC2檢測(cè)方法是首個(gè)獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)證的HPV檢測(cè)方法。HC2檢測(cè)原理是一種采用免疫技術(shù)并通過化學(xué)發(fā)光使信號(hào)放大的檢測(cè)方法，可以檢測(cè)13種HR-HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68），不具體區(qū)分型別。該試劑在檢測(cè)宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變2 級(jí)（cervical intraepithelial neoplasia grade 2， CIN2）及以上（CIN2＋），具有高的靈敏度（87％～96％）和陰性預(yù)測(cè)值[4]，因此該方法已成為各種HPV檢測(cè)技術(shù)的參照試劑[5]。Care HPV是一種快速HPV DNA檢測(cè)方法，其檢測(cè)原理為抗體結(jié)合順磁性磁珠技術(shù)，該檢測(cè)方法可檢測(cè)14種高危HPV型別（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68）[6]。與傳統(tǒng)的HPV檢測(cè)方法相比，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便易行，對(duì)取樣人員及實(shí)驗(yàn)室條件要求較低，檢測(cè)時(shí)間較短。Cervista HPV檢測(cè)試劑的主要原理是基于Cleavase酶切信號(hào)放大法檢測(cè)高危型HPV。在等溫反應(yīng)下，由Cleavase酶特異性識(shí)別并切割分子結(jié)構(gòu)，通過分子雜交和化學(xué)信號(hào)放大，從而直接檢測(cè)特定的HPV DNA序列。該產(chǎn)品擁有Cervista HPV HR和Cervista HPV16/18兩種試劑，F(xiàn)DA于2009年批準(zhǔn)的這兩種試劑在宮頸篩查中可用于ASCUS分流和細(xì)胞學(xué)聯(lián)合篩查[7]。2. 靶標(biāo)擴(kuò)增技術(shù)：靶標(biāo)擴(kuò)增技術(shù)主要通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 擴(kuò)增結(jié)合其他的方法檢測(cè)核酸，是應(yīng)用最廣泛的一種方法。（1）通用引物聚合酶鏈反應(yīng)法（polymerase chain reaction，PCR）：大多數(shù)通用引物主要針對(duì)高度保守且在不同型別中突變頻率較低的L1區(qū)[8]。目前商品化的檢測(cè)試劑包括：①Linear Array檢測(cè)試劑采用PGMY09 / 11系統(tǒng)[9]進(jìn)行擴(kuò)增分型。該方法操作簡(jiǎn)便易行、價(jià)格低廉，但需要相對(duì)較大的PCR片段，特別是對(duì)于一些斷裂的、不易于擴(kuò)增的DNA樣本如福爾馬林固定的標(biāo)本和石蠟包埋的標(biāo)本等，且該方法不能對(duì)HPV進(jìn)行特異分型，也不適用于HPV多重感染[10]。國(guó)產(chǎn)多種試劑均是通過優(yōu)化GP5+ / GP6+ PCR系統(tǒng)[11]進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。HPV檢測(cè)試劑INNO-LiPA HPV genotype assay是通過SPF10 PCR體系[12]結(jié)合反式雜交法，建立了對(duì)32種不同型別HPV分型的檢測(cè)試劑。（2）熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）：該方法采用針對(duì)某個(gè)HPV基因型的特異引物及探針擴(kuò)增病毒DNA序列。這種方法的靈敏度和特異度較高，可以進(jìn)行病毒載量測(cè)定，也可以明確HPV的具體型別，不需要進(jìn)行后續(xù)分析，但單通道檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)只能檢測(cè)1種HPV型別，如需檢測(cè)多個(gè)型別，則要在不同的反應(yīng)體系中進(jìn)行。Cobas 4800檢測(cè)試劑是這種檢測(cè)方法的典型代表，其檢測(cè)原理是基于特異性PCR熒光探針法的檢測(cè)試劑，在單個(gè)反應(yīng)中，包含一組針對(duì)HPV L1區(qū)的特異性引物和人β-球蛋白的基因，可以同時(shí)檢測(cè)14種高危型HPV，包括HPV16、18、其他12種HPV類型（HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68），可以對(duì)HPV16及18具體分型，而對(duì)其他12種HPV類型則不能進(jìn)行具體分型，人β-球蛋白的基因?yàn)閮?nèi)對(duì)照（internal control，IC），該方法已于2014年通過美國(guó)FDA的認(rèn)證[13-14]。一些國(guó)產(chǎn)HPV分型檢測(cè)試劑檢測(cè)方法均屬于此類。與Cobas 4800檢測(cè)技術(shù)不同的是，這些檢測(cè)技術(shù)是在單一反應(yīng)中，設(shè)計(jì)3種或4種特異性引物，檢測(cè)4個(gè)通道并分析出具體型別[5]。由于國(guó)產(chǎn)HPV檢測(cè)試劑種類繁多，結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，通常以試劑說明書為依據(jù)進(jìn)行結(jié)果判讀。（3）基于PCR的后續(xù)分析方法：該方法先使用針對(duì)HPV序列較為保守的位置的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)分析即可確定HPV的基因型別，并且可以同時(shí)檢測(cè)多種HPV基因型。廣東潮州凱普生物公司的導(dǎo)流雜交法（HybriMax）是HPV基因型分型檢測(cè)方法，集導(dǎo)流雜交與基因芯片技術(shù)的優(yōu)勢(shì)于一體，能同時(shí)對(duì)21種HPV基因（HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、81）進(jìn)行分型，且可判斷多重感染。（4）mRNA擴(kuò)增技術(shù)：研究表明，HPV RNA比HPV DNA能夠更加精確地甄別發(fā)病高風(fēng)險(xiǎn)人群或?qū)m頸病變的進(jìn)展，因此高危型HPV的檢測(cè)也可以針對(duì)病毒的mRNA來進(jìn)行，E6 / E7 mRNA可能是宮頸癌篩查的有效生物標(biāo)志物[15]。Aptima（transcription mediated amplification，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)，即TMA技術(shù)）即針對(duì)于E6 / E7的mRNA進(jìn)行的，擁有Aptima HPV和Aptima 16、18 / 45兩種產(chǎn)品，于2011年獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)，是第1個(gè)獲FDA認(rèn)證的HPV mRNA檢測(cè)技術(shù)，Aptima HPV可以檢出14種高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68），但不能夠具體分型。Aptima16、18 / 45可以區(qū)分檢測(cè)HPV16型，對(duì)于18/45型的HPV感染僅能混合報(bào)告陽(yáng)性或陰性，而無(wú)法區(qū)分具體的型別。該方法的檢出限為24~488拷貝/ mL，S/CO值為0.5。由于Aptima不是采用宮頸脫落細(xì)胞內(nèi)的保守基因進(jìn)行內(nèi)質(zhì)控的，因此，該方法的HPV檢測(cè)存在交叉反應(yīng)。而且由于RNA的不穩(wěn)定性，標(biāo)本不宜長(zhǎng)期保存。（5）二代測(cè)序（next generation sequence，NGS）：NGS檢測(cè)HPV DNA是發(fā)展較快的一種技術(shù)，可進(jìn)行全基因組測(cè)序或特定區(qū)域的序列測(cè)定。該技術(shù)可提供給每例患者不同的數(shù)據(jù)，包括感染病毒類型、病毒載量、病毒狀態(tài)和病毒插入位點(diǎn)等。尤其對(duì)于多重感染的樣本，能夠準(zhǔn)確檢出低拷貝的HPV亞型[16]。華大基因推出了基于NGS平臺(tái)的HPV分型基因檢測(cè)技術(shù)-SeqHPV，可對(duì)14種高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)和2種低危型HPV(6、11型)進(jìn)行精準(zhǔn)的分型檢測(cè)。二、HR-HPV檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用場(chǎng)景及結(jié)果解讀我國(guó)自2000年開始使用HPV檢測(cè)技術(shù)，國(guó)家藥監(jiān)局（NMPA）批準(zhǔn)了超過100種方法/產(chǎn)品用于HPV核酸檢測(cè)，例如，實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（QPCR）法、雜交捕獲法、等溫?cái)U(kuò)增及基因芯片法等。在眾多的HPV檢測(cè)試劑中如何選擇適用的試劑是大家較為關(guān)注的問題。NMPA關(guān)于“人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測(cè)及基因分型試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則”以及國(guó)際相關(guān)研究指出：初篩試劑應(yīng)選擇適當(dāng)陽(yáng)性閾值[17]，并在30到60歲篩查人群隊(duì)列中（包含>60例CIN2 +病例）驗(yàn)證其篩查高度病變（HSIL）的靈敏度和特異度（參考值為0.90和0.98）[18-20]。因此，在選擇HPV核酸檢測(cè)試劑時(shí)，應(yīng)與相應(yīng)的預(yù)期用途相結(jié)合。同時(shí)考慮中國(guó)龐大人口的公共衛(wèi)生需求以及成本效益，可基于衛(wèi)生資源而選擇不同初篩方法。1. HR-HPV檢測(cè)的臨床意義：HPV是一種常見病毒，耐酸堿，外界存活可達(dá)1周，主要通過性接觸傳播。80%的女性一生都會(huì)感染HPV而且不會(huì)表現(xiàn)出任何癥狀，70%～90%的HPV感染無(wú)癥狀，在1～2年內(nèi)可自行轉(zhuǎn)陰，僅有5%～10%的HPV 感染會(huì)持續(xù)[21]。高危型人乳頭狀瘤病毒（high risk human papailloma virus，HR-HPV）包括14種：HPV16/18/31/33/35/39/45/ 51/52/56/58/59/66/68。HR-HPV持續(xù)感染導(dǎo)致幾乎所有的宮頸鱗癌[22]，從HPV感染進(jìn)展為浸潤(rùn)性宮頸癌通常需要20多年。低危型人乳頭狀瘤病毒（low risk human papailloma virus，LR-HPV）主要包括HPV6/11/30/42/43/44/61 等，其中HPV6/11 感染可引起90%的生殖器疣[21,23]。我國(guó)宮頸鱗癌患者中，HPV16 最常見（76.6%），其次是HPV18（7.9%）、HPV31（3.2%）、HPV52（2.2%）和HPV58（2.2%）；子宮頸腺癌患者中常見的感染型別為HPV16、18型[21,23]。2. HR-HPV檢測(cè)在感染人群分流中的意義：HR-HPV檢測(cè)技術(shù)雖然能夠較為靈敏地篩查出宮頸癌和癌前病變，但特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值卻不高[24]，常常會(huì)造成不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診和（或）過度診斷及治療，既浪費(fèi)衛(wèi)生資源，又對(duì)婦女身心造成不必要的傷害。因此，對(duì)HPV初篩陽(yáng)性婦女的分流必不可少。我國(guó)一項(xiàng)納入了60,732例受試者的大樣本研究推薦，農(nóng)村地區(qū)可采用基于雜交捕獲原理的高危型HPV檢測(cè)，對(duì)于HPV陽(yáng)性（HPV不分型）采用細(xì)胞學(xué)、VIA/VILI等分流，或直接陰道鏡檢查；城市采用FQ-PCR、等溫?cái)U(kuò)增等高危型HPV分型技術(shù)，對(duì)于HPV16、18 陽(yáng)性可直接轉(zhuǎn)診陰道鏡，其它12種HPV 陽(yáng)性采用細(xì)胞學(xué)分流[25-26]，或采用p16/Ki-67雙染技術(shù)分流[27-28]。由于HPV陽(yáng)性人群的分流方法尚無(wú)統(tǒng)一意見。采用何種方法分流HPV陽(yáng)性人群既要考慮分流策略效果，也應(yīng)根據(jù)不同國(guó)家和地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展情況因地制宜。3. HPV檢測(cè)結(jié)果解釋：HPV檢測(cè)結(jié)果一般包括三類：無(wú)效結(jié)果、陰性結(jié)果、某一個(gè)或某幾個(gè)HPV型別陽(yáng)性結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果判讀均參照試劑說明書。對(duì)于無(wú)效結(jié)果需重新復(fù)檢；對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果提示有HPV感染。樣本管中靶基因檢測(cè)結(jié)果應(yīng)結(jié)合對(duì)照品（質(zhì)控品）以及和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述。檢驗(yàn)結(jié)果的解釋應(yīng)以臨床試驗(yàn)結(jié)論為依據(jù)。如有適用的臨床診療或篩查指南，則應(yīng)在此項(xiàng)下引用，相應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果的解釋應(yīng)符合相關(guān)指南的要求。綜上所述，盡管HPV核酸檢測(cè)技術(shù)眾多，在實(shí)際工作中需結(jié)合預(yù)期用途及衛(wèi)生資源狀況選擇最適用的HPV核酸檢測(cè)技術(shù)，最有效地降低女性宮頸癌的發(fā)病率。
注：本文來源于《臨床實(shí)驗(yàn)室》雜志2021年第5期“分子診斷”專題
