單位：解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心檢驗科
【摘要】目的 結合ISO 15189，探討保存溫度、保存時間及溶血對丙型肝炎病毒RNA定量測定的影響。方法 將HCV RNA陽性患者血清，與高溶血血漿及正常人陰性血清按不同比例混合，得到高、中、低及無溶血四種樣本，2 ml樣本管分裝之后，分別置于室溫（25℃）、4℃、-20℃保存6h、24h、48h、3d、5d、7d、14d、21d、28d后，進行HCV RNA定量測定，均值取對數后進行相應統計學分析。結果 當保存溫度為-20℃，保存時間自第14天開始，丙肝定量對數均值與初始值相比差異出現統計學顯著性（P值<0.05）；當保存溫度為4℃，保存時間自第5天開始，丙肝定量對數均值與初始值相比差異出現統計學顯著性（P值<0.05）；當保存溫度為室溫25℃，保存時間自第14天開始，結果差異出現統計學意義（P值<0.05）。當保存溫度為-20℃、4℃及25℃時，低、中度溶血樣本與無溶血樣本相比，丙肝定量對數均值的差異均無統計學意義（P值>0.05），高度溶血樣本與無溶血樣本相比，差異均有統計學意義（P值<0.05）。結論 對于有待進行HCV RNA定量檢測的性狀正常血清樣本，-20℃保存，不宜超過兩周；4℃保存，不宜超過3d；室溫下放置或者運輸，不宜超過48h。對于溶血樣本，應當考慮到溶血造成的影響：輕微溶血情況下（Hb 3 g/L、Hb 12 g/L）短時間儲存影響較小，但如果溶血情況嚴重，血紅蛋白濃度大于12 g/L，HCV RNA定量結果降低明顯。
【關鍵詞】 聚合酶鏈反應；溶血；保存條件；肝炎病毒；核酸
結合ISO 15189，探討保存溫度、保存時間及溶血對丙型肝炎病毒RNA定量測定的影響。
1.材料：HCV RNA模板提取采用湖南圣湘全自動Natch S磁珠法核酸提取儀；PCR擴增及檢測采用湖南圣湘HCV RNA熒光定量PCR檢測試劑盒，擴增儀采用Roche480。2.方法：（1）溶血制備：選取HCV RNA、抗-HCV、抗-HIV及HBsAg均為陰性的正常人EDTA-K2抗凝全血，洗滌3遍后，置于-80℃下反復凍融使紅細胞全部破裂，經3500rpm，離心10min，取上層液體作為高溶血樣本。（2）樣本準備：選取HCV RNA陽性患者（HCV RNA濃度10E5左右），采用分離膠采血管采血，3500rpm，10min立即分離血清并分裝10.0ml離心管多管，作為陽性樣本。選取HCV RNA，抗-HCV、抗-HIV及HBsAg均為陰性的血清作為陰性樣本。（3）實驗步驟：將陽性樣本，陰性樣本和已制備的高溶血樣本按不同比例混合，配制成高（Hb約43g/L）、中（Hb約12g/L）、低（Hb約3g/L）及無溶血四種溶血程度的樣本，分置于室溫（25℃）、4℃、-20℃保存6h、24h、48h、3d、5d、7d、14d、21d、28d后進行HCV RNA測定[3]。所有時間點樣本設置雙管，取對數后求均值，每批次實驗均設置陰陽對照[4]。3.統計學方法：運用SPSS17.0軟件對數據進行二因素方差分析。
1.不同保存溫度下保存時間對HCV RNA定量的影響：如表1所示，當保存溫度為-20℃，保存時間自第14天開始，丙肝定量對數均值與初始值相比差異出現統計學顯著性（P值<0.05），而從ISO 15189質控標準看，直到第21天才出現失控。當保存溫度為4℃，保存時間自第5天開始，丙肝定量對數均值與初始值相比差異出現統計學顯著性（P值<0.05），同時按照ISO 15189質控標準也提示失控。當保存溫度為室溫25℃，保存時間自第14天開始，結果差異出現統計學意義（P值<0.05），而按照ISO 15189質控標準在第3天已出現失控[5]。
2.不同保存溫度下溶血對HCV RNA定量的影響：如表2所示，當保存溫度為-20℃、4℃及25℃時，低、中度溶血樣本與無溶血樣本相比，丙肝定量對數均值的差異均無統計學意義（P值>0.05），高度溶血樣本與無溶血樣本相比，差異均有統計學意義（P值<0.05）[6]。
3.不同溫度下保存時間和溶血對HCV RNA定量的主效應關系：如表3所示，保存溫度為-20℃及4℃時，保存時間和溶血程度對HCV RNA定量對數均值有顯著作用（P值<0.05）。保存溫度為25℃時，保存時間對HCV RNA定量對數均值有顯著作用（P值<0.05）,而溶血程度未見統計學顯著性（P值>0.05），提示樣本室溫放置時，放置時間對HCV RNA定量結果的影響相較于溶血而言更為重要[7]。
4.不同溶血情況下丙肝定量對數均值隨時間變化關系：如圖1-4所示，在無溶血以及低、中度溶血的情況下，丙肝定量對數均值隨時間下降的趨勢基本一致，保存溫度-20℃和4℃的變化趨勢基本吻合，保存溫度為25℃則在5d后下降非常明顯[8]。而在高度溶血情況下，丙肝定量對數均值隨時間變化的趨勢有顯著改變。由此我們可以看出，將樣本置于室溫保存，相較與冷藏及冷凍保存而言，將會嚴重影響HCV RNA的定量測定，兩日后降低明顯，5日后HCV RNA定量值直線下滑。另外，實驗發(fā)現，在高度溶血情況下，丙肝定量對數均值的波動較大，核酸提取效率穩(wěn)定性差。
1.保存溫度和保存時間對結果的影響：目前用于HCV RNA定量檢測的部分商用試劑盒在樣本前處理方面，建議不能及時進行HCV RNA測定的應當在離心分離血清后6小時內吸取血清至小管并于-20℃冷凍保存?zhèn)溆�，此舉在樣本量大的情況下無疑給實驗室增加了勞動量，并因開蓋操作引入了交叉污染的可能，那么真的有這個必要嗎？本次實驗結果得出如下結論：-20℃保存血清樣本，不宜超過1周；在4℃保存，不宜超過3d；在室溫下放置（包括運輸），不宜超過48h。此結果與莊養(yǎng)林等的研究結果，在 4℃和25℃ 條件下保存時間一致，僅僅在-20℃結論不同，莊養(yǎng)林等認為可保存4周，而我們要求更為嚴格，僅能穩(wěn)定一周，這可能取決于各自的核酸提取方法及實驗條件的不同。通常來說，保存時間影響HCV RNA病毒定量的主要原因為RNA病毒核酸受到內源性及外源性RNase的影響。外源性RNase主要來自于空氣、皮膚、毛發(fā)和被污染的實驗臺。由于RNA酶的活性受到溫度的影響，酶的活性影響酶的反應效率，從而導致了RNA降解速度的改變，低溫有助于抑制RNase活性[9]。在實際的臨床實驗室檢測過程中，ISO 15189最新版CNAS-CL36（醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在基因擴增檢驗領域的應用說明）的附錄A.2規(guī)定：“自建檢測系統不精密度要求：以能力驗證/室間質評評價界限（靶值±0.4對數值）作為允許總誤差（TEa），重復性精密度<3/5TEa；中間精密度<4/5Tea”的相關要求，本次實驗以4/5Tea （即“靶值±0.32對數值”）作為可接受定量范圍，與統計學顯著性相結合，綜合兩方面的考慮，得出上述最終的實驗結論，較單純使用統計學結論更符合實際需求[10]。2.溶血對結果的影響：關于溶血對HCV RNA定量的影響，有文獻指出是通過血紅蛋白的卟啉環(huán)與 Taq酶發(fā)生不可逆結合從而抑制了Taq酶活性，影響了RNA的定量測定。本實驗研究顯示，當保存溫度為-20℃、4℃及25℃時，樣本中高濃度的血紅蛋白（Hb 43g/L）會對HCV RNA定量結果造成一定干擾，但在中、低濃度血紅蛋白（Hb ≤12g/L）對結果的影響則無統計學意義[11]。有文獻認為，血紅蛋白濃度大于8g/L時會影響HCV RNA的檢測，而在陳曉華等的研究則認為，溶血組與對照組的檢測結果相比差異無統計學意義。對于上述不同的研究結論，我們認為可能原因主要為核酸的提取方法不相同。例如在陳曉華的研究中，選用的核酸提取方法為柱提法，而本次實驗我們選用的是磁珠法。另外，劉長利等的采用Roche核酸提取柱提取核酸的研究中，指出柱提法可有效去除血紅素分子，避免溶血對結果的影響[12]。在此實驗中，我們還發(fā)現，高濃度血紅蛋白組有少量樣本未得到有效結果，甚至內標也出現了被抑制而無法檢出的情況。猜測可能的原因是當血紅蛋白的濃度過高時，血清粘度大，采用磁珠法提取核酸的情況下，血清中的血紅蛋白可能會與磁珠粘附，從而影響核酸的提取效率，并且如果提取殘液中未清洗干凈的血紅蛋白混入PCR反應體系可能造成Taq酶受抑制，另外，血紅蛋白為堿性物質，殘留量過大的話也有可能會影響反應液的PH值，從而導致整個反應體系被抑制，樣本及內標均無法檢出。因此，選擇合適的核酸提取方法及設備并正確維護對于降低溶血等因素對于HCV RNA定量檢測的干擾至為重要[13]。3.綜合因素的影響：通過對保存溫度和血紅蛋白濃度的主效應進行統計分析，我們發(fā)現一個現象，當保存溫度為-20℃和4℃時，溶血對定量結果的影響差異有顯著性，但當保存溫度為室溫時，溶血的影響卻不再具有顯著性差異。對于這一現象，目前在其他研究中暫未發(fā)現。我們懷疑可能的原因是，室溫下血紅蛋白的活性隨保存時間的延長有極大的降低，可能是內、外源性酶的影響或者微生物的影響，也不排除操作不當及誤差造成影響的可能，對于相關問題，有待于我們進一步研究[14]。此外，本次研究還發(fā)現，當保存溫度為4℃和25℃，在第24h時HCV RNA定量結果均出現輕微反彈，而非如預期般隨著時間而一直持續(xù)下降的趨勢。對此我們考慮是否是實驗過程中操作不當造成的誤差[15]。但在其他文獻中也曾出現過與此相似的報道，如在Gessoni等的研究中，4/6的丙肝定量標本在24h后結果出現上升，而在之后又逐漸下降；在姚鳳蘭等的研究中也出現了類似的情況[16]。但目前對于這種現象發(fā)生的原因還不清楚[17]。總而言之，標本的前處理在HCV RNA定量檢測中有重要意義，標本的接收和保存是整個質量控制體系中第一環(huán)。在臨床檢驗實踐工作中，我們應將本次實驗研究結果與ISO 15189質控規(guī)定相結合，制訂合理可行的標本接收及保存規(guī)范，從前處理開始，做好質量控制的第一步，從而提高HCV RNA定量檢測的準確性。
1.保存溫度和保存時間對HCV RNA定量的影響：對于HCV RNA定量檢測而言，溫度越低越有利于標本保存，保存時間越長標本中核酸降解的越多，定量值越偏離真實值。具體規(guī)定：在-20℃保存的血清樣本，不宜超過1周；在4℃保存，不宜超過3d；在室溫下放置，不宜超過48h；更長時間的保存建議放在-80℃下。2.溶血對HCV RNA定量的影響：實驗室在接收樣本做HCV RNA定量檢測時，如果發(fā)現溶血樣本，重度溶血可考慮讓臨床重新抽血送檢。輕微溶血情況下（Hb 3g/L、Hb 12g/L）應及時檢測，結果影響不大，不能及時檢測的應當低溫保存，并于規(guī)定時間內檢測。
注：本文來源于《臨床實驗室》雜志2021年第5期“分子診斷”專題
本文轉載自臨床實驗室
