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本文轉載自檢驗星空 新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南 為指導各級疾控部門和其他相關機構開展新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測工作，特制定本技術指南。 一、標本采集 （一）采集對象 新型冠狀病毒肺炎疑似病例和聚集性病例，需要進行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者，或其他需要進一步篩查檢測的環(huán)境或生物材料。 （二）標本采集要求 1．從事新型冠狀病毒檢測標本采集的技術人員應經過生物安全培訓（培訓合格）和具備相應的實驗技能。采樣人員個人防護裝備（Personal ProtectiveEquipment，PPE）要求：N95及以上防護口罩、護目鏡、連體防護服、雙層乳膠手套、防水靴套；如果接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物，應及時更換外層乳膠手套。 2．住院病例的標本由所在醫(yī)院的醫(yī)護人員采集。 3．密切接觸者標本由當?shù)刂付ǖ募部貦C構、醫(yī)療機構負責采集。 4．根據(jù)實驗室檢測工作的需要，可結合病程多次采樣。 （三）采集標本種類 每個病例必須采集急性期呼吸道標本（包括上呼吸道標本或下呼吸道標本），重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標本；根據(jù)臨床需要可留取便標本、全血標本、血清標本。 標本種類： 1．上呼吸道標本：包括鼻咽拭子、咽拭子等。 2．下呼吸道標本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、呼吸道吸取物等。 3．便標本：留取糞便標本約10克（花生大�。�，如果不便于留取便標本，可采集肛拭子。 4．血液標本：盡量釆集發(fā)病后7天內的急性期抗凝血，采集量5ml,建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集血液。 5．血清標本：盡量釆集急性期、恢復期雙份血清。第一份血清應盡早（最好在發(fā)病后7天內）釆集，第二份血清應在發(fā)病后第3～4周釆集。采集量5ml，建議使用無抗凝劑的真空釆血管。血清標本主要用于抗體的測定，不進行核酸檢測。 （四）標本采集和處理 1．鼻咽拭子：采樣人員一手輕扶被采集人員的頭部，一手執(zhí)拭子，拭子貼鼻孔進入，沿下鼻道的底部向后緩緩深入，由于鼻道呈弧形，不可用力過猛，以免發(fā)生外傷出血。待拭子頂端到達鼻咽腔后壁時，輕輕旋轉一周（如遇反射性咳嗽，應停留片刻），然后緩緩取出拭子，將拭子頭浸入含2～3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。 2．咽拭子：被采集人員先用生理鹽水漱口，采樣人員將拭子放入無菌生理鹽水中濕潤(禁止將拭子放入病毒保存液中，避免抗生素引起過敏)，被采集人員頭部微仰，嘴張大，并發(fā)“啊”音，露出兩側咽扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，將拭子頭浸入含2～3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶 液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管 蓋。咽拭子也可與鼻咽拭子放置于同一管中。 3．鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒導 尿管接在50ml注射器上來替代收集器）。 4．深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的50ml螺口塑料管中。如果痰液未收集于采樣液中，可在檢測前，加入2～3ml采樣液，或加入痰液等體積的痰消化液。 痰消化液儲存液配方：
臨用前將儲存液以去離子水稀釋至100ml。也可以采用痰液等體積的含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液將痰液化。 5．支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒導尿管接在50ml注射器上來替代收集）。 6．肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支管，將其頂端契入支氣管分支開口，經氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30～50ml，總量100～250ml，不應超過300ml。 7．糞便標本：取1ml標本處理液，挑取黃豆粒大小的便標本加至管中，輕輕吹吸3-5次，室溫靜置10分鐘，以8000rpm離心5分鐘，吸取上清液進行檢測。 糞便標本處理液可自行配制：1.211 g Tris，8.5 g氯化鈉，1.1g無水氯化鈣或1.47g含結晶水的氯化鈣，溶解至800ml 去離子水中，用濃鹽酸調節(jié)pH為7.5，以去離子水補充至1000ml。 也可使用HANK’S液或其它等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液溶解便標本制備便懸液。如患者出現(xiàn)腹瀉癥狀，則留取糞便標本3～5ml，輕輕吹打混勻后，以8000rpm離心5分鐘，吸取上清液備用。 8．肛拭子：用消毒棉拭子輕輕插入肛門3～5cm，再輕輕旋轉拔出，立即放入含有3～5ml病毒保存液的15ml外螺旋蓋采樣管中，棄去尾部，旋緊管蓋。 9．血液標本：建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集血液標本5ml，根據(jù)所選用核酸提取試劑的類型確定以全血或血漿進行核酸提取。如需分離血漿，將全血1500～2000rpm離心10分鐘，收集上清于無菌螺口塑料管中。 10．血清標本：用真空負壓采血管采集血液標本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于無菌螺口塑料管中。 其他材料：依據(jù)設計需求規(guī)范采集。 （五）標本包裝 本采集后在生物安全二級實驗室生物安全柜內分裝。 1．所有標本應放在大小適合的帶螺旋蓋內有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里，擰緊。容器外注明樣本編號、種類、姓名及采樣日期。 2．將密閉后的標本裝入密封袋，每袋限一份標本。樣本包裝要求要符合《危險品航空安全運輸技術細則》相應的標準。 3.涉及外部標本運輸?shù)�，應根�?jù)標本類型，按照A類或B類感染性物質進行三層包裝。 （六）標本保存 用于病毒分離和核酸檢測的標本應盡快進行檢測，能在24小時內檢測的標本可置于4℃保存；24小時內無法檢測的標本則應置于-70℃或以下保存（如無-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存）。血清可在4℃存放3天，-20℃以下可長期保存。應設立專庫或專柜單獨保存標本。標本運送期間應避免反復凍融。 （七）標本送檢 標本采集后應盡快送往實驗室，如果需要長途運輸，建議采用干冰等制冷方式進行保藏。 1．上送標本 各�。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）聚集性病例的標本，上送中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所進行檢測復核，并附樣本送檢單（見附表）。 2．病原體及標本運輸 2.1國內運輸 新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬于A類，對應的聯(lián)合國編號為UN2814，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術細則》的PI602分 類包裝要求；環(huán)境樣本屬于B類，對應的聯(lián)合國編號為UN3373，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術細則》的PI650分類包裝要求；通過其他交通工具運輸?shù)目蓞⒄找陨蠘藴拾b。 新型冠狀病毒毒株或其它潛在感染性材料運輸應按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》（原衛(wèi)生部令第45號）辦理《準運證書》。 2.2國際運輸新型冠狀病毒毒株或樣本在國際間運輸?shù)模瑧?guī)范包裝，按照《出入境特殊物品衛(wèi)生檢疫管理規(guī)定》辦理相關手續(xù)，并滿足相關國家和國際相關要求。 2.3毒株和樣本管理新型冠狀病毒毒株及其樣本應由專人管理，準確記錄毒株和樣本的來源、種類、數(shù)量，編號登記，采取有效措施確保毒株和樣本的安全，嚴防發(fā)生誤用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。 二、新型冠狀病毒的實驗室檢測 新型冠狀病毒感染的常規(guī)檢測方法為實時熒光RT-PCR。任何新型冠狀病毒的檢測都必須在具備條件的實驗室由經過相關技術安全培訓的人員進行操作。本指南中的核酸檢測方法主要針對新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框1ab（openreading frame1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsidprotein，N）。 實驗室確認陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個： 1.同一份標本中新型冠狀病毒2個靶標（ORF1ab、N）實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。如果出現(xiàn)單個靶標陽性的檢測結果，則需要重新采樣，重新檢測。如果仍然為單靶標陽性，判定為陽性。 2.兩種標本實時熒光RT-PCR同時出現(xiàn)單靶標陽性，或同種類型標本兩次采樣檢測中均出現(xiàn)單個靶標陽性的檢測結果，可判定為陽性。 核酸檢測結果陰性不能排除新型冠狀病毒感染，需要排除可能產生假陰性的因素，包括：樣本質量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運輸和處理樣本；技術本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。 三、實時熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸 （一）目的 規(guī)范實時熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸的工作程序，保證實驗結果的正確可靠。 （二）范圍 適用于實時熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸。 （三）職責 檢測人員：負責按照本檢測細則對被檢樣本進行檢測。 復核人員：負責對檢測操作是否規(guī)范以及檢測結果是否準確進行復核。 部門負責人：負責對科室綜合管理和檢測報告的審核。 （四）樣本接收和準備 核對被檢樣本姓名、性別、年齡、編號及檢測項目等；待檢樣本的狀態(tài)如有異常，需注明；待檢樣本應存放于-70℃冰箱保存。 （五）檢測項目 1.新型冠狀病毒核酸測定（實時熒光RT-PCR方法）推薦選用針對新型冠狀病毒的ORF1ab、N基因區(qū)域的引物和探針。 靶標一（ORF1ab）： 正向引物（F）： CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 反向引物（R）： ACGATTGTGCATCAGCTGA 熒光探針（P）： 5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3' 靶標二（N）: 正向引物（F）： GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT 反向引物（R）： CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG 熒光探針（P）： 5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3' 核酸提取和實時熒光RT-PCR反應體系及反應條件參考相關廠家試劑盒說明。 2.結果判斷 陰性：無Ct值或Ct≥40。 陽性：Ct值<37，可報告為陽性。 灰度區(qū)：Ct值在37-40之間，建議重復實驗，若重做結果Ct值<40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性,否則為陰性。 注：如果用的是商品化試劑盒，則以廠家提供的說明書為準。 四、病原生物安全實驗活動要求 根據(jù)目前掌握的新型冠狀病毒的生物學特點、流行病學特征、臨床資料等信息，該病原體暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進行管理，具體要求如下： （一）病毒培養(yǎng) 病毒培養(yǎng)是指病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產生活病毒的重組實驗等操作。上述操作應當在生物安全三級實驗室的生物安全柜內進行。使用病毒培養(yǎng)物提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒 培養(yǎng)等同級別的實驗室和防護條件下進行，裂解劑或滅活劑加入后可比照未經培養(yǎng)的感染性材料的防護等級進行操作。實驗室開展相關活動前，應當報經國家衛(wèi)生健康委批準，取得開展相應活動的資質。 （二）動物感染實驗 動物感染實驗是指以活病毒感染動物、感染動物取樣、感染性樣本處理和檢測、感染動物特殊檢查、感染動物排泄物處理等實驗操作，應當在生物安全三級實驗室的生物安全柜內操作。實驗室開展相關活動前，應當報經國家衛(wèi)生健康委批準，取得開展相應活動的資質。 （三）未經培養(yǎng)的感染性材料的操作 未經培養(yǎng)的感染性材料的操作是指未經培養(yǎng)的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進行的病毒抗原檢測、血清學檢測、核酸提取、生化分析，以及臨床樣本的滅活等操作，應當在生物安全二級實驗室進行，同時采用生物安全三級實驗室的個人防護。 （四）滅活材料的操作 感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進行的核酸檢測、抗原檢測、血清學檢測、生化分析等操作應當在生物安全二級實驗室進行。分子克隆等不含致病性活病毒的其他操作，可以在生物安全一級實驗室進行。
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