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以下文章來源于德安實(shí)驗(yàn)診斷 ，作者郭小兵
PCR技術(shù)一經(jīng)問世，就被迅速而廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。因具有高度特異性、靈敏度，故PCR技術(shù)在臨床疾病診斷及病院微生物鑒定中，成為極為重要的實(shí)驗(yàn)手段。在新冠肺炎疫情防控中，PCR檢測(cè)技術(shù)更是具有不可替代的實(shí)驗(yàn)診斷價(jià)值。PCR反應(yīng)體系涉及靶標(biāo)、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶以及Mg2+等多個(gè)要素。近期，因?yàn)楸本┑貐^(qū)發(fā)現(xiàn)新冠核酸檢測(cè)單基因陽性，“靶標(biāo)”概念一度成為大家討論的熱點(diǎn)。
靶標(biāo)，就是擴(kuò)增模板，或者說是目的基因，即我們檢測(cè)病原體時(shí)，擴(kuò)增的基因片段。從新冠核酸檢測(cè)來說，我們檢測(cè)的靶標(biāo)多為新型冠狀病毒基因組中N基因和ORF1ab基因。
啥樣的基因可作為PCR擴(kuò)增檢測(cè)的靶標(biāo)？
作為靶標(biāo)，其主要的特征就是特異性，或者說高度保守性。通俗地講，就是靶標(biāo)基因片段是病原菌所獨(dú)有的。特異性的高低，直接決定著PCR檢測(cè)的精準(zhǔn)程度。特異性越高，準(zhǔn)確度越高。在病原體檢驗(yàn)實(shí)踐中，目的基因均是高度保守位點(diǎn)，故靶標(biāo)的特異性均可保證，結(jié)果準(zhǔn)確性也會(huì)有保障。對(duì)于新冠核酸檢測(cè)靶標(biāo)而言，ORF1ab基因最為保守，故其PCR擴(kuò)增檢測(cè)的特異性要優(yōu)于N基因。
靶標(biāo)原始量對(duì)于PCR精準(zhǔn)檢測(cè)有影響嗎？
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)每次循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號(hào)（擴(kuò)增產(chǎn)物量），實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)（目的基因）的定量分析，因此靶標(biāo)原始量直接著影響檢測(cè)結(jié)果。一般而言，靶標(biāo)原始量對(duì)于精準(zhǔn)檢驗(yàn)影響可歸結(jié)為兩點(diǎn)。載量過高且超出了所用方法的檢測(cè)線性范圍時(shí)，檢測(cè)結(jié)果會(huì)欠精準(zhǔn)，不利于治療監(jiān)測(cè)。故部分PCR檢測(cè)方法在病原體載量過高時(shí)，系統(tǒng)會(huì)提示工作人員稀釋標(biāo)本后再行檢測(cè)；載量過低且低于或接近所用方法的最小檢測(cè)限度，即靈敏度時(shí)，會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
總體來看，靶標(biāo)原始量涉及標(biāo)本中病原體量及病原體自身靶標(biāo)拷貝數(shù)。
1.標(biāo)本中病原體量 是指標(biāo)本中所含病原體的數(shù)量。病原體量越大，靶標(biāo)的載量越高。2.病原體自身靶標(biāo)拷貝數(shù) 是指靶標(biāo)在病原體內(nèi)的拷貝數(shù)。不同的基因靶標(biāo)在病原體內(nèi)拷貝數(shù)存在差異。 以新冠核酸檢測(cè)為例，若患者處于活動(dòng)期，尤其是德爾塔毒株感染時(shí)，標(biāo)本中病毒/靶標(biāo)載量會(huì)較高，實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性有保證；若患者處于感染初期，或者是無癥狀感染者、治療恢復(fù)期患者等時(shí)，標(biāo)本中的病毒/靶標(biāo)載量會(huì)很低，此時(shí)會(huì)有假陰性的結(jié)果出現(xiàn)。需要我們關(guān)注的一點(diǎn)是，新型冠狀病毒核酸序列中，ORF1ab 基因只存在于完整的病毒基因組中，N 基因可同時(shí)存在于全長(zhǎng)基因組和其他亞基因組 RNA中，而病毒體內(nèi)亞基因組有一定的豐度，故同時(shí)作為PCR擴(kuò)增靶標(biāo)，N 基因原始拷貝數(shù)顯著多于 ORF1ab基因。基于此，對(duì)感染初期、無癥狀感染者、治療恢復(fù)期等病毒載量較低患者檢測(cè)時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)N基因單基因陽性的現(xiàn)象。此點(diǎn)從病毒感染狀態(tài)及病毒體內(nèi)靶標(biāo)拷貝數(shù)差異方面詮釋了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)單基因陽性的原因，也是對(duì)方法學(xué)上解釋單基因陽性的有效補(bǔ)充。從技術(shù)原理上來看，與單一拷貝靶標(biāo)相比，選擇病原體內(nèi)拷貝數(shù)較高的基因片段作為靶標(biāo)，相當(dāng)于提高了PCR檢測(cè)的靈敏度，檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確。
如何減小靶標(biāo)因素造成的檢測(cè)誤差？
1.若方法本身可有效克服擴(kuò)增反應(yīng)間的干擾，則盡量選擇雙和或多靶標(biāo)PCR技術(shù)。3.選擇病原體內(nèi)高拷貝保守基因片段作為靶標(biāo)。4.關(guān)注靶標(biāo)基因序列變異，若突變涉及擴(kuò)增起始位點(diǎn)，則需重新選擇靶標(biāo)。
1. 丁香園，新冠病毒基因組特性分析與檢測(cè)試劑性能的關(guān)聯(lián)性2. 科普 | 新冠病毒各種檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比
來源：德安實(shí)驗(yàn)診斷
