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本文轉(zhuǎn)載自臨床實(shí)驗(yàn)室 定向點(diǎn)金 金寶 自2019年底以來，新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的出現(xiàn)給全球公共衛(wèi)生界帶來了新傳染病的挑戰(zhàn)。 在此次疫情中，新冠病毒RNA檢測已被證明對COVID-19的早期診斷起著非常重要的作用，相對其它檢測方法，基于核酸的檢測方法具有更高靈敏度和特異性的優(yōu)勢，這將有利于控制傳染源，從而有效防控疫情。 而隨著診斷需求的不斷增加和核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展，分子POCT技術(shù)以低成本、易操作、快速和即時檢測的優(yōu)勢越來越受到人們的關(guān)注。 本文主要從分子POCT技術(shù)和檢測產(chǎn)品方面總結(jié)目前已有的新冠病毒核酸快速檢測方法及原理，以期為分擔(dān)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的壓力，在檢測能力不足或資源匱乏地區(qū)合理應(yīng)用分子POCT技術(shù)，實(shí)現(xiàn)新冠病毒核酸的快速檢測或篩查，從而提高各級醫(yī)療衛(wèi)生防疫機(jī)構(gòu)及時應(yīng)對新冠疫情的處置能力。 一、核酸快速擴(kuò)增技術(shù) 1. 快速熒光RT-PCR：在核酸檢測中，熒光RT-PCR是最廣泛用于檢測SARS-CoV-2的方法。通過將熒光RT-PCR與快速技術(shù)相結(jié)合，如數(shù)字微流體、可視化檢測和便攜式儀器，可以實(shí)現(xiàn)快速和簡單的RT-PCR反應(yīng)（5-30分鐘）。 但容易受到諸如低靈敏度、樣品通量低等限制。 對于缺乏儀器的發(fā)展中國家或其他資源有限的環(huán)境，節(jié)省成本和快速的熒光RT-PCR方法將有利于全球新冠疫情防控。 2. 等溫?cái)U(kuò)增：用于快速診斷新冠病毒核酸的三種常見的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP），逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增（RT-RPA）和逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（RT-RAA）。 a. 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增具有操作簡單、成本低、快速高效等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于許多人類疾病的檢測和診斷。 b. 逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增的優(yōu)勢在于它僅需要兩個引物，而環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增則需要至少四個引物。 c. 逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增是RT-PCR檢測SARS-CoV-2的可行性替代方案，尤其在基礎(chǔ)設(shè)施有限的偏遠(yuǎn)地區(qū)。 〔逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（RT-RAA）是一種具有中國知識產(chǎn)權(quán)的新型的恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)，在較低的溫度（一般為37℃）條件下，就可以實(shí)現(xiàn)DNA或者RNA的快速擴(kuò)增。 該方法具有高度特異性，不會與其他重要病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，靈敏度與RT-PCR相當(dāng)，適合在縣級鄉(xiāng)鎮(zhèn)發(fā)熱門診和口岸檢測機(jī)構(gòu)為疑似新型冠狀病毒感染者、密切接觸者、入境人員進(jìn)行快速篩查。〕 二、整體化分子POCT檢測技術(shù)產(chǎn)品 自SARS-CoV-2基因組測序完成后，用于檢測SARS-CoV-2的實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的測試（LDTs）很快被開發(fā)出來。 其中許多商業(yè)試劑盒已經(jīng)上市，并通過美國食品和藥物管理局（FDA）、歐盟的緊急使用授權(quán)（EUA）和中國國家食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）批準(zhǔn)。 表1：國內(nèi)外市場主流分子POCT產(chǎn)品 三、面臨的挑戰(zhàn)與展望 目前檢測SARS-CoV-2核酸的主要的挑戰(zhàn)依然是對特定設(shè)備的要求高，新冠肺炎診斷耗時過程長，診斷中心/機(jī)構(gòu)有限。 因此迫切需要低成本，便攜，快速，易于使用的分子POCT技術(shù)，可適用于資源有限、傳播SARS-CoV-2風(fēng)險(xiǎn)較高的偏遠(yuǎn)地區(qū)，低收入至中等收入國家的機(jī)場和當(dāng)?shù)厣鐓^(qū)醫(yī)院等。 由于SARS-CoV-2感染會導(dǎo)致類似流感的癥狀，對呼吸道感染的鑒別診斷對于控制新冠病毒在人群內(nèi)的傳播至關(guān)重要。 此外，SARS-CoV-2會導(dǎo)致有癥狀和無癥狀感染，而無癥狀感染者具有傳染性，可感染其他人群。價(jià)格低廉的便攜式診斷系統(tǒng)可有助于對高風(fēng)險(xiǎn)人群（如密接人群）進(jìn)行大規(guī)模篩查，以及時阻斷傳播鏈。 RT-PCR被廣泛應(yīng)用于新冠病毒檢測，具有較高的敏感性和特異性，但其分析需要各種設(shè)備和受過培訓(xùn)的分析人員，只有在成熟的實(shí)驗(yàn)室才能完成。 LAMP是一種超靈敏的核酸擴(kuò)增方法，通�？梢栽诖蠹s一個小時內(nèi)檢測到少量的DNA或RNA模板，但高溫的要求仍然限制了它的適用性，易導(dǎo)致假陽性。 基于CRISPR的核酸檢測方法可以在37℃的恒溫下工作，但SHERLOCK 系統(tǒng)受到目標(biāo)基因指數(shù)預(yù)放大的限制，影響檢測靈敏度，同時準(zhǔn)確定量較困難。 分子POCT技術(shù)產(chǎn)品操作簡單，檢測相對快速，但通量不高。 因此，開發(fā)更有效、更實(shí)用的方法來克服現(xiàn)有方法的不足是非常必要的。 選擇合適的檢測方法是非常重要，在實(shí)際應(yīng)用中，通常將幾種方法結(jié)合起來，盡量避免單一方法的缺點(diǎn)。 只有根據(jù)實(shí)際場景需要和具體目的平衡各種檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)，才能獲得最經(jīng)濟(jì)、最優(yōu)的選擇。 隨著基于交叉學(xué)科的新技術(shù)、新方法的快速發(fā)展，我們相信未來會開發(fā)出更適用和更高效的檢測技術(shù)，為臨床實(shí)驗(yàn)室提供更多的選擇。 |