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以下文章來源于檢驗科 ，作者王童 李琦 單位：中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院檢驗科實時熒光定量PCR技術(shù)是目前檢測新型冠狀病毒核酸的主要方法，該技術(shù)是通過監(jiān)測PCR反應過程中所加入熒光基團的熒光信號，利用已知濃度的標準品繪制標準曲線，對未知樣品進行定量分析的一種核酸定量技術(shù)。在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見”，最后通過循環(huán)閾值( Cycle threshold，Ct) 和標準曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析。PCR擴增過程中，每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度。隨著反應循環(huán)次數(shù)的不斷增加，所擴增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，反應中產(chǎn)生的熒光信號強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正比。儀器實時檢測和采集的熒光信號，隨著時間和循環(huán)數(shù)的不斷增加，產(chǎn)生一條反映實時熒光信號強度變化的曲線，稱為擴增曲線。擴增曲線以循環(huán)數(shù)為橫坐標，熒光強度為縱坐標。樣本擴增曲線是反應PCR進程的鏡子，我們可以通過觀察擴增曲線來評估PCR擴增效率，分析實驗是否順利進行。擴增曲線的正常與否，反映出實驗中存在的諸多因素和問題，對新冠核酸檢測結(jié)果判讀至關(guān)重要。
正常PCR擴增曲線呈“S”型，分為基線期、指數(shù)期、平臺期。擴增曲線良好的指標是曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，基線平而無上揚現(xiàn)象。理論上，PCR每個循環(huán)后擴增產(chǎn)物量即增加一倍，擴增曲線應表現(xiàn)為熒光值隨著循環(huán)數(shù)增加而不斷上升。而實際上，擴增曲線的熒光值并不會隨著循環(huán)數(shù)的增加而無限上升。這是由于PCR擴增進行到一定階段，反應體系中的原料發(fā)生消耗和變性，如dNTP和酶等原料相對于模板大大減少，同時酶活性逐漸達到飽和；引物二聚體和反應亞產(chǎn)物（如焦磷酸）的產(chǎn)生也會抑制擴增反應；引物和已擴增的DNA片段間的競爭等都會導致PCR的擴增效率逐步降低，直至為0。因此，擴增曲線表現(xiàn)為擴增到一定的循環(huán)數(shù)后，熒光值不再隨著循環(huán)數(shù)發(fā)生變化，而是保持平坦，出現(xiàn)平臺期。
1、擴增曲線抬升，與閾值線相交產(chǎn)生了CT值 ① 軟件在進行基線自動扣除的時候出現(xiàn)錯誤，引起了擴增曲線抬升；② 選用的耗材、試劑或者操作的原因，導致背景熒光信號有所波動，造成反應孔的自動基線扣除錯誤；③ 探針濃度過高，體系中有熒光物質(zhì)污染，擴增效率低。① 采取手動調(diào)整基線的方法，重新定義基線即可正常（即將基線起點改為熒光信號穩(wěn)定的循環(huán)數(shù)，基線終點設置成擴增曲線起峰的前一個循環(huán)數(shù)）；② 重新提取樣本、重新配置試劑（可采用不同廠家試劑檢測），注意人員操作；① 儀器不穩(wěn)定導致的擴增曲線異常（也可能突然停電或者電壓不穩(wěn)）；② 尖峰向下，可能是鹵素燈老化所致發(fā)射光源不穩(wěn)定（指鹵鎢燈光源的激發(fā)器）；③ 尖峰向上，考慮儀器或者孔位問題，還要考慮反應體系是否存有氣泡。② 定期儀器保養(yǎng)維修，避免配件老化問題出現(xiàn)；④ 配制反應體系，分裝避免產(chǎn)生大量氣泡，模板加完，微孔板離心再擴增。③ 正常樣本曲線末尾起跳，懷疑模板存在交叉污染；或者樣本濃度低、加樣量不準確導致擴增效率低；④ 所用的試劑設計不合理，或存在交叉污染，或操作環(huán)境中有氣溶膠造成污染。② 復檢樣本，如果復檢后曲線為陰性直線則說明之前的末尾起跳為非特異性擴增，如果復檢后曲線與之前一樣末尾起跳則表示該樣本中待檢病毒核酸的濃度偏低；④ 對操作環(huán)境進行處理或更換新的環(huán)境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。熒光波長范圍存在重疊，影響PCR檢測通路采集熒光信號。① 模板污染導致降解，或者樣本濃度低、加樣量不準確導致擴增效率低；① 重新提取樣本，排除提取效率變低、加樣量不足等因素；PCR前期過程中，試劑和模板沒有得到充分的混勻，導致信號的不穩(wěn)定，反應幾個循環(huán)之后，模板和反應液開始混勻，熒光信號就變得穩(wěn)定。① 檢查試劑，更換新試劑，雙試劑檢測；試劑配制充分混勻，分裝準確；9、標準曲線異常，線性關(guān)系不佳R2<0.9（下圖為正常曲線）③ 檢查耗材，更換試劑，避免環(huán)境存在抑制物。① PCR反應板封膜不嚴或質(zhì)量不好，在PCR過程中受到水蒸氣的影響；① PCR反應板封膜壓實，選擇配套耗材，有瑕疵的及時更換；① 10個循環(huán)左右開始有抬高趨勢，一般前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，此時反應體系和模板處于不穩(wěn)定狀態(tài)；② 基線自動扣除的時候出現(xiàn)錯誤，引起了擴增曲線抬升；嚴重的蒸發(fā)會呈現(xiàn)先上升后下降的曲線，輕微的蒸發(fā)會是一種緩慢的上升，這類異常曲線可檢查檢測后的反應管液面是否有下降的現(xiàn)象來證明。上機檢測前檢查96微孔板封膜完好，保證無縫隙后上機擴增。
綜上所述，在新型冠狀病毒核酸檢測PCR實驗過程中，許多方面的因素都可干擾PCR擴增曲線，影響新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果的判讀。當我們遇到擴增曲線異常的情況，需要我們正確解讀分析這些異常曲線，找出存在的問題及合理的解決方案，為患者出具準確的新型冠狀病毒核酸檢測的結(jié)果報告。[1]趙桂芝.做PCR實驗你遇到過這些問題嗎？前輩的經(jīng)驗分享.[2021-11-04].[2]PCR異常擴增曲線分析攻略.檢驗星空.[2021-11-29].
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