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本文轉載自實驗醫(yī)學 聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用于擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,被看作是生物體外的DNA復制,將微量的DNA片段進行大幅擴增,從而達到容易鑒定和識別的程度。 對于PCR反應而言,“酶”起著至關重要的作用,并且每一種“酶”都具有不同的活性和功能。那么,都有哪些種類的酶呢?在IVD領域中又有哪些應用呢? DNA聚合酶 ![]() 定義:它是以DNA為模板,從DNA5,端復制到3,端,催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一類酶。 主要活性及作用:催化DNA合成。1、聚合作用。2、3,→5,外切酶活性—校對作用3、5,→3,外切酶活性—切除修復作用4、焦磷酸水解作用5、焦磷酸交換作用。 在IVD領域中常見的DNA 聚合酶包括:Taq熱啟動酶,在反應體系加熱至70℃之前,采用化學修飾的方法封閉Taq酶的活性,進而抑制非特異性擴增。高保真DNA聚合酶,含有聚合中心和酶切中心,聚合中心具有5’-3’聚合酶活性,負責聚合作用;酶切中心具有3’-5’外切酶活性(也稱校對活性),負責將不配對的核苷酸予以切除。 定義:該酶以RNA為模板,按5'-3'方向合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈的酶。 主要活性及作用:1、RNA指導的DNA聚合酶活性。2、RNase H活性3、以DNA指導的DNA聚合酶活性。 在IVD領域的應用:1、逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)2、cDNA文庫構建3、RNA測序4、RT-qPCR ,2019新冠核酸檢測所配置的體系試劑當中,必然會加入逆轉錄酶。因為RNA病毒必須逆轉錄為DNA,才能進行PCR反應。 ![]() 定義:以一條DNA或RNA鏈為模板的聚合酶,因為在細胞內與DNA的遺傳信息轉錄有關,也稱為轉錄酶。 主要活性及作用:1、與DNA為模板;2、催化核苷酸通過聚合反應合成核酸;3、使核苷酸形成3,→5,—磷酸二酯鍵;4、按5'-3'方向按照堿基互補配對原則轉錄模板序列。 在IVD領域中常見的RNA聚合酶包括:T7 RNA聚合酶,專門催化5'→3'方向的RNA形成過程。目前體外診斷中,SAT技術就是應用T7 RNA聚合酶進行RNA擴增。該技術已經被廣泛應用到病原體檢測、血液病毒篩查、環(huán)境微生物檢測等領域。 ![]() 定義:蛋白酶K是一種從白色念珠菌分離出來的強力蛋白溶解酶,是DNA提取的關鍵試劑。 主要作用:使膜蛋白和DNA結合的蛋白質降解,促進DNA游離。在IVD領域中應用:用于質粒、基因組DNA、RNA的分離和抽提。在病毒核酸檢測中,蛋白酶K可以裂解病毒的外殼蛋白并使其失活,同時將病毒基因組釋放完成核酸抽提。 ![]() 定義:別名是尿嘧啶-DNA糖基化酶也稱為尿嘧啶 -N- 糖基化酶或UNG酶。是形成DNA、RNA單體以及編碼遺傳信息的化學結構。 作用:高效控制PCR殘余污染。在IVD領域中應用:在臨床檢驗的PCR試劑中含有UDG酶,以防止污染。 ![]() 定義:識別特定的核苷酸序列,并對每條鏈中特定部位的兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶,簡稱限制酶。 作用:共分為3種類型:1型:同時具有修飾及識別切割的作用,其切割位距離識別序列很遠。2型:只具有識別切割的作用,所切割位即識別序列。3型:同時具有修飾及識別切割的作用,切割位與識別序列較近。 在IVD領域中應用:1、基因定位和基因分離2、DNA分子堿基序列分析3、進行基因工程編輯。4、DNA物理圖譜的組建 ![]() 定義:利用ATP水解提供的能量來解開雙鏈DNA核苷酸配對形成的氫鍵,從而形成單鏈DNA。 作用:在DNA或RNA復制過程中起到催化DNA或RNA解旋的作用。 在IVD領域中應用:等溫擴增技術,利用熱穩(wěn)定解旋酶代替qPCR中的熱變性過程,解開雙鏈并延伸擴增。該技術不易產生非特異性擴增,同時也避免了PCR循環(huán)中升降溫的過程,只需簡單的設備即可檢測。 ![]() 定義:是能催化稀有堿基參入RNA或DNA,或對原有堿基進行修飾的酶,以防止限制性內切酶的破壞。 作用:將其他酶的結構進行共價修飾,使其在高活性形式和相對較低的活性形式之間互相轉變。 在IVD領域中應用:5mC/m6A核酸修飾酶活性檢測HTMR方法為靶向DNA/RNA甲基化的小分子調控劑的發(fā)現及活性評價提供強有力的證據。 ![]() 定義:是一種催化一分子焦磷酸鹽轉化為兩分子磷酸鹽離子的酶。 作用:熱穩(wěn)定無機焦磷酸酶在100℃加熱4h仍然具有100%活性,因此可用于PCR反應,解除生成的無機焦磷酸鹽對PCR的抑制,增強DNA復制。 ![]() 定義:是抗Taq DNA 聚合酶的抗體。 作用:PCR擴增時,高溫變性前Taq Antibody與Taq 酶結合抑制DNA聚合酶活性,能夠在低溫條件下有效抑制引物的非特異性退火及引物二聚體引起的非特異性擴增。 在IVD領域中應用:高封閉效率Taq antibody可提高新冠病毒核酸檢測試劑盒的檢測靈敏度,助力新冠檢測。 標準PCR過程分為三步:DNA變性、退火、延伸。在PCR開始升溫到50℃10min或95℃2min即可發(fā)生滅活反應,UDG酶將反應體系中污染DNA產生的擴增消除。隨后,模板DNA經過高溫變性為單鏈DNA。在DNA聚合酶和適宜的溫度下,兩條引物分別和兩條模板DNA鏈發(fā)生退火。又在DNA聚合酶下進行延伸。Taq Antibody與Taq 酶結合抑制DNA聚合酶活性,在低溫條件下抑制非特異性擴增。在PCR反應中添加無機焦磷酸酶,焦磷酸水解為正磷酸,增加了反應的擴增效率。 原料酶是分子檢測行業(yè)的上游產業(yè)鏈。2020年,在巨大的核酸檢測需求面前,市場對分子診斷試劑需求劇增,原料酶行業(yè)也因此得到快速發(fā)展。在生產方面,由于分子檢測原料酶生產技術門檻較高,當前國內市場則主要依賴于進口。近年來,伴隨著國內生產工藝的崛起,多家原材料企業(yè)上市,產品類別也逐漸豐富,但不可否認的是,國內IVD原材料行業(yè)仍處于發(fā)展初期,市場占比也較小,未來必然存在較大提升空間。 來源:MIR醫(yī)學儀器與試劑 |