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本文轉(zhuǎn)載自檢驗(yàn)星空 新冠疫情不斷蔓延，核酸檢測(cè)在疫情的防控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為了監(jiān)測(cè)“提取、擴(kuò)增”等環(huán)節(jié)，目前市場(chǎng)上已有多個(gè)產(chǎn)品均在核酸擴(kuò)增試劑內(nèi)加入了“內(nèi)標(biāo)”，包括“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”和“外源性內(nèi)標(biāo)”，兩種方式各有利弊。 “內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”的一個(gè)優(yōu)勢(shì)就是可監(jiān)測(cè)“采樣”[1]。這樣的說法并不能完全囊括所有的臨床場(chǎng)景；例如：在“單檢”過程中，內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)僅能監(jiān)測(cè)采集到足夠人體細(xì)胞，不能判斷采樣部位是否正確；其次，在大規(guī)�！盎鞕z”中，標(biāo)本漏檢也難以發(fā)現(xiàn)。 因此，在實(shí)際工作中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，選擇合適的試劑；并且無論使用哪種內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增試劑，都需要保證采用過程的規(guī)范化。 “內(nèi)標(biāo)”、“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”和“外源性內(nèi)標(biāo)”是什么 在檢驗(yàn)工作中，如PCR擴(kuò)增靶標(biāo)基因擴(kuò)增呈現(xiàn)“陰性”，存在哪些可能性呢？ 可能受試者為“真陰性”，也可能是由于采樣、提取和擴(kuò)增階段存在問題，導(dǎo)致的“假陰性”[2]。各個(gè)廠家為了減少“假陰性”的發(fā)生率，通過改變核酸擴(kuò)增試劑的配置，可通過檢測(cè)內(nèi)標(biāo)核酸是否“起線”，判斷是否存在“采樣、提取、擴(kuò)增”導(dǎo)致的假陰性。 內(nèi)標(biāo)分為“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”和“外源性內(nèi)標(biāo)”，兩者的分析比較如下表[3]:
“外源性內(nèi)標(biāo)“可更好監(jiān)測(cè)提取、擴(kuò)增過程： 外源性內(nèi)標(biāo)是在擴(kuò)增體系中的提前加入的“定量”核酸分子，擴(kuò)增中Ct值的變化幅度較�。钞a(chǎn)品內(nèi)標(biāo)Ct值為：30±1），因此當(dāng)外源性內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增Ct值明顯變大時(shí)，提示核酸提取不足，或反應(yīng)體系中存在抑制物等。 然而內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)是人體的管家基因，隨著采集的人體細(xì)胞加入反應(yīng)體系，擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值較大時(shí)，可能的原因不僅包括核酸提取不足、反應(yīng)體系中存在抑制物等，也可能是由于并未采集到足夠的細(xì)胞。
擴(kuò)增過程中，某樣本內(nèi)標(biāo)的Ct值升高 可能原因分析
“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”起線≠采樣成功 試驗(yàn)方案1 納入了健康志愿者10名，分別口咽拭子采集人體口腔標(biāo)本，使用“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”擴(kuò)增試劑，“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”擴(kuò)增結(jié)果如下圖所示，1~9號(hào)樣本Ct值為20.0~28.1，10號(hào)樣本Ct值為24.8；所有樣本“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”均起線，10號(hào)樣本并未見明顯異常。
1~9號(hào)樣本 Ct值：20.0~28.1
10號(hào)樣本 Ct值：24.8 事實(shí)上，1~9號(hào)樣本在采樣過程中，嚴(yán)格按照SOP操作采樣，可以認(rèn)為是采樣成功的樣本。10號(hào)樣本取樣未按SOP操作，采樣拭子僅碰及志愿者上顎，可以認(rèn)為是采樣失敗的樣本。 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)我們可以認(rèn)為，在“單檢”場(chǎng)景下，“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”起線，不能說明采樣過程合理規(guī)范，采樣部位準(zhǔn)確可靠。 試驗(yàn)方案2 試驗(yàn)對(duì)象均為健康受試者，通過采集志愿者口腔標(biāo)本，制作“10混1”的混檢樣本共計(jì)11個(gè)，分別為11~21號(hào)樣本。所有標(biāo)本使用“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”擴(kuò)增試劑，“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”擴(kuò)增結(jié)果如下圖所示，11~19號(hào)樣本Ct值為22.8~28.2，20號(hào)樣本Ct值為25.8，21號(hào)樣本Ct值為26.0；所有樣本“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”均起線，20號(hào)和21號(hào)樣本并未見明顯異常。
事實(shí)上，11~19號(hào)“10混1”的樣本中，均加入了10個(gè)嚴(yán)格按照SOP操作采樣的標(biāo)本，可以認(rèn)為是采集成功的樣本，并未漏檢。而20號(hào)樣本中混入了1個(gè)空拭子，21號(hào)樣本中混入了2個(gè)空拭子，可以認(rèn)為是漏檢了1個(gè)或2個(gè)受試者的樣本。 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)我們可以認(rèn)為，在“混檢”場(chǎng)景下，“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”起線，不能說明采樣過程合理規(guī)范，采樣依然存在漏檢風(fēng)險(xiǎn)。 小結(jié) 綜上，“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”和“外源性內(nèi)標(biāo)”擴(kuò)增試劑各有利弊，我們需要根據(jù)具體的應(yīng)用場(chǎng)景，不同的檢測(cè)樣本，選擇合適的擴(kuò)增試劑。另外“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”起線，說明采集到了足夠的人體細(xì)胞，但并不能說明采樣規(guī)范合理；在新冠疫情依然存在的今天，我們每一個(gè)人均應(yīng)積極配合醫(yī)務(wù)工作人員，保證采樣的規(guī)范合理，共同為疫情防控努力。 參考文獻(xiàn) [1]關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)奧密克戎等新型變異株疫情防控工作的通知 [2]Estimating the false-negative test probability of SARS-CoV-2 by RT-PCR. Euro Surveill. 2020 Dec17; 25(50): 2000568. [3] Reference genes inreal-time PCR. J Appl Genet. 2013 Nov;54(4):391-406. 來源：檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) |
