|
|
本文轉(zhuǎn)載自李萍 謝小兵 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)網(wǎng) 作者：李萍 謝小兵 單位：湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 筆者所在的實(shí)驗(yàn)室從2020年新冠疫情初期就開展了新冠核酸檢測項(xiàng)目，親歷過疫情初期國內(nèi)還沒有及時(shí)生產(chǎn)配套的新冠病毒采集管、咽拭子以及試劑盒性能不穩(wěn)定的艱苦階段。 再到后期眾多性能優(yōu)越的試劑盒上市，配套取樣的耗材及使用越來越規(guī)范，我們見證了這兩年多來新冠核酸采集以及檢測技術(shù)規(guī)范的不斷更新和優(yōu)化，也深刻理解了“單檢”、“混檢”、“單采”以及“混采”這些名稱每一次推出其背后的工作所需以及現(xiàn)實(shí)意義。
我們在日常工作中經(jīng)常會接到來自臨床醫(yī)生和民眾的電話咨詢，特別是混采收費(fèi)低于單采收費(fèi)后，好多民眾就會問：混采的結(jié)果是不是不準(zhǔn)確��？混采結(jié)果是陰性還要不要再去做個(gè)單采等等問題。 今天我們就一并來解釋一下“單檢”、“混檢”、“單采”和“混采”這些概念的區(qū)別以及對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。 單檢即“單個(gè)檢測”，指樣本采集時(shí)是將1個(gè)人的拭子單獨(dú)放在1根病毒采集管中，這根采集管里通常含3mL病毒保存液（注：我們在實(shí)際工作中也會建議對疑似患者采樣時(shí)同時(shí)采口咽拭子和鼻咽拭子，共2根拭子一起放入1根采集管中，以提高檢出率）。 每個(gè)采集管單獨(dú)作為一個(gè)獨(dú)立的樣本進(jìn)行檢測，比如檢測試劑盒說明書中要求加原始樣本200μl，那么這份單檢樣本就按200μl加入進(jìn)行核酸提取。
混檢即“混合檢測”，樣本采集完全同單檢的方法，即1個(gè)人用1根病毒采集管（3mL病毒保存液），只是在核酸檢測時(shí)為了提高檢測效率和檢測通量，把幾個(gè)人的病毒采樣管里的液體都減少加樣量，幾個(gè)人受檢者占用1個(gè)檢測通量進(jìn)行后續(xù)的核酸提取和擴(kuò)增。 比如，檢測試劑盒說明書要求加原始樣本200μl，采用5個(gè)人混檢方案的話，那就是每個(gè)人加入原始樣本量40μl（200μl/5人份=40μl/人份），其他檢測步驟不變。
單采即“采集單個(gè)樣本”，這個(gè)名稱強(qiáng)調(diào)的是采集過程，是在混采方案推行后用于區(qū)別于混采的一種名稱，其實(shí)質(zhì)就是和單檢是一樣的，1個(gè)人占用1根采集管，核酸檢測時(shí)也通常會單檢，應(yīng)用范圍自然與單檢的一樣。 混采即“采集混合樣本”，采集多個(gè)人的樣本放在一起，以提高效率�；觳捎址譃�5合1混采、10合1混采以及20合1混采。 2020年8月17日，國務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制醫(yī)療救治組（簡稱救治組）發(fā)布《關(guān)于印發(fā)新冠病毒核酸10合1混采檢測技術(shù)規(guī)范的通知》[1]；2022年1月15日救治組發(fā)布《關(guān)于印發(fā)新冠病毒核酸20合1混采檢測技術(shù)規(guī)范的通知》[2]。這兩份通知里都詳細(xì)介紹了對病毒采集管和采樣拭子的要求，對于10合1的采集管，要求內(nèi)含6ml胍鹽或其他有效病毒滅活劑的保存液；對于20合1的采集管，要求內(nèi)含11-12ml胍鹽或其他有效病毒滅活劑的保存液。 10合1是指將采集自10人的10支拭子集合于1個(gè)采集管中進(jìn)行核酸檢測的方法，20合1是指將采集自20人的20支拭子集合于1個(gè)采集管中進(jìn)行核酸檢測的方法。 混采適用于全員或區(qū)域大規(guī)模新冠篩查，可明顯提高檢測效率、加快檢測速度。
以上介紹了“單檢”、“混檢”、“單采”和“混采”這些概念的區(qū)別，下面針對“單檢”、“混檢”、“單采”和“混采”對核酸檢測結(jié)果的影響逐一進(jìn)行解析。 因新冠核酸篩查所用的技術(shù)主要就是熒光PCR技術(shù)，所以今天只討論不同的采集方案對熒光PCR檢測結(jié)果的影響。 任何一個(gè)診斷指標(biāo)都有兩個(gè)最基本的特征，即敏感性和特異性。用熒光PCR技術(shù)檢測新冠核酸時(shí)，通俗的理解，其敏感性就是在真正的新冠感染者中，該方法能做出陽性結(jié)果的能力或百分率，敏感性越高，其不漏診的機(jī)會就越大；所謂特異性，就是在沒有感染新冠的人群中，該方法能做出是陰性結(jié)果的能力或百分率，特異性越高，其不誤診的機(jī)會就越大。 對于單獨(dú)一個(gè)指標(biāo)，如果提高其診斷的敏感性，必然降低其診斷的特異性，換句話說，減少漏診必然增加誤診，反之亦然，即提高其特異性，會降低敏感性。 對于目前傳播力（R0為9.5）如此強(qiáng)大的奧密克戎變異株，更需提高其敏感性，自然也就會犧牲其部分特異性。那怎樣在盡可能不降低特異性的基礎(chǔ)上又能提高其敏感性呢？當(dāng)然是多次篩查！請先看下面分析：
圖源：新華社 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3]：2020年在對廣州市20348例密切接觸者的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，第1、2、3和第7輪核酸檢測的敏感性與特異性分別為69.14%與99.99%、89.84%與99.99%、97.27%與99.99%、100%與99.98%。有相當(dāng)一部分的感染者要經(jīng)過多次篩查才能做出陽性，是PCR這個(gè)檢測技術(shù)不好嗎？我們來分析一下。 敏感性達(dá)不到最理想狀態(tài)的100%，原因有很多，比如病程早期病毒載量低、樣本收集的過早或過晚、未取到有效部位、沒有正確的保存、運(yùn)輸和處理樣本導(dǎo)致病毒RNA降解、口咽部食物或藥物等含有PCR抑制物、病毒基因變異以及檢測試劑盒靈敏度不高等因素。 在這兒先解釋一下“靈敏度“這個(gè)術(shù)語，它和敏感性看上去很相似但實(shí)際上是完全不同的兩個(gè)概念。靈敏度是指檢測試劑或檢測體系的最低分析濃度或最低檢出限，比如甲公司生產(chǎn)的核酸檢測試劑能檢測到的最低病毒原始濃度是500拷貝數(shù)/mL，乙公司生產(chǎn)的試劑能檢測到的最低病毒原始濃度是100拷貝數(shù)/mL，那么對于200拷貝數(shù)/mL這樣一個(gè)病毒含量很低的樣本，甲公司試劑做出來的結(jié)果是陰性（靈敏度不夠，低濃度未能檢出），乙公司試劑做出來則是陽性，因此試劑盒檢測靈敏度是影響這個(gè)方法敏感度的重要因素。 除了試劑本身靈敏度對敏感性的影響以外，其他因素如取樣不到位、病程早期病毒含量低、標(biāo)本運(yùn)輸和保存不當(dāng)，以及口咽部取材時(shí)含有未知的PCR抑制物等這些分析前因素也是影響整體敏感性下降的重要原因。 就拿PCR抑制物來說，咽拭子這類標(biāo)本由于受口/鼻咽部分泌物以及進(jìn)食、飲酒、吸煙等因素影響，會使樣本的成分變得復(fù)雜。目前已證實(shí)乙醇（飲酒）、血紅素（出血）、肝素（肝素抗凝管）、植物多糖（糞便或植物）、蛋白酶（牛奶）、膽酸鹽（糞便）、鈣離子（帶有滑石粉的手套）等等成分可以抑制PCR擴(kuò)增，還有很多未知的可以抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，這些抑制物需要盡可能在取樣時(shí)避免或者在提取核酸的過程中將其去除，否則會引起核酸擴(kuò)增抑制，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。 通過以上分析可知，要想提高新冠核酸檢測的敏感性，不僅需要靈敏度高的檢測試劑，還需要控制檢驗(yàn)前的各種影響因素。在此基礎(chǔ)上，通過多次篩查可明顯提高監(jiān)測敏感性。
圖源：新華社 那接下來要說的就是單檢、混檢、單采、混采對敏感性的影響，其實(shí)就是這些不同的樣本采集方式是否會對上述所提到的因素有影響。
現(xiàn)在以10混檢為例，假如10份樣本中有1份是陽性樣本，其余9份都是陰性樣本，按照試劑盒說明書提取核酸時(shí)單檢加樣200μl，那么10混檢的話，這份陽性樣本在核酸提取時(shí)只加進(jìn)去20μl，相當(dāng)于病毒含量被稀釋了10倍，這樣出來的病毒擴(kuò)增曲線會向右平移，平移多少個(gè)循環(huán)數(shù)呢？這里要做一個(gè)理想型的數(shù)學(xué)模式來推算。
以10倍的倍比稀釋后的模板擴(kuò)增曲線 理論上，一系列稀釋的樣品擴(kuò)增曲線之間有均勻的間距。那么: 5倍稀釋的DNA樣品，2n=5，n=Log2 (5)=2.32 10倍稀釋的DNA樣品，2n=10，n=Log2 (10)=3.32 20倍稀釋的DNA樣品，2n=20，n=Log2(20)=4.32 n為倍比稀釋后的兩條相鄰曲線之間的Ct值差距。 Ct值全稱Cycle threshold，即循環(huán)閾值，其含義是指擴(kuò)增到一定的循環(huán)數(shù)時(shí)，其擴(kuò)增產(chǎn)物所攜帶的熒光值可以達(dá)到能被檢測到的臨界值水平，這時(shí)候所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)就是其Ct值。 所以稀釋后的標(biāo)本與原始標(biāo)本相比，需要比原先更多的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)才能達(dá)到檢測臨界值，其Ct值是增加的，曲線會右移。 由此可見，以10混檢、擴(kuò)增程序設(shè)置總循環(huán)數(shù)是40為例，如果其中一個(gè)樣本的病毒在單檢時(shí)其Ct值大于36.68，那么在混檢時(shí)其擴(kuò)增曲線就會向右平移3.32個(gè)循環(huán)，也就是說混檢后就檢測不出來了，結(jié)果就是陰性。 那該如何避免混檢所帶來的弱陽性樣本漏檢的風(fēng)險(xiǎn)呢？
筆者建議可以通過加大擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，比如要做10混檢的話，就在原先40個(gè)擴(kuò)增的程序上再增加3-5個(gè)循環(huán)，這樣就可避免Ct值為36左右的弱陽性樣本漏檢。 當(dāng)然對于Ct值大于36.68的樣本，這是屬于非常弱的樣本，但其對應(yīng)的病毒載量究竟是多少？單純這個(gè)定性實(shí)驗(yàn)無法得知，必須有新冠病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線才能準(zhǔn)確計(jì)算出來。 在這里需要指出的是：不僅是咽拭子，還有宮頸脫落細(xì)胞、潰瘍面分泌物等這類標(biāo)本，由于受取樣時(shí)拭子擦拭力度和擦拭次數(shù)的影響，取樣的初始量不容易標(biāo)準(zhǔn)化，不能像檢測血液中乙肝病毒、丙肝病毒那樣可以精準(zhǔn)控制血清加樣量，因此在進(jìn)行分泌物標(biāo)本的核酸檢測項(xiàng)目時(shí)通常是做的定性試驗(yàn)，而不是絕對定量試驗(yàn)。 定性實(shí)驗(yàn)就不能過分依賴單次的分泌物樣本的Ct值結(jié)果，需要第二次甚至更多次取樣復(fù)核，兩次取樣的Ct值相差較大也是可能的。 此外，混檢帶來的另一個(gè)隱患是其中的一個(gè)或幾個(gè)樣本即使因采樣不到位，因其內(nèi)參基因會被其他樣本的內(nèi)參基因掩蓋，而失去了內(nèi)參基因監(jiān)測樣本取樣是否合格的內(nèi)質(zhì)控作用。因此，對于疑似患者、發(fā)熱門診就診患者、新冠患者的病程觀察、密接者的篩查時(shí)，不建議用混檢的方法。
以10合1混采為例，前面已介紹過，10合1混采是10個(gè)人的拭子放在1個(gè)管子里，管子里的液體是6mL，相對于單采管的3mL來說，混采里某個(gè)樣本的病毒濃度是被稀釋了1倍。 我們?nèi)砸?0個(gè)樣本中有1個(gè)為陽性，其余9個(gè)樣本都為陰性的例子來看，提取核酸時(shí)加的總液體量仍然是200μl，由于這個(gè)陽性患者的病毒濃度被稀釋了1倍，因此最終的Ct值會延后1【計(jì)算公式n=Log2 (2)=1】。那假如這10個(gè)混采的人里面有2個(gè)人是陽性，那就和單采是一樣的了，敏感性不會減弱；那如果大于2個(gè)人陽性，那就比單采的敏感性還高。 不管是5混采，10混采，還是20混采，都可以按以上這個(gè)理論推算出來。但要注意的是以上計(jì)算都是理論上和理想條件（核酸提取效率為100%，核酸擴(kuò)增效率也是100%）下的計(jì)算方法，而實(shí)際工作中核酸提取效率和擴(kuò)增效率不一定100%，所以按以上公式計(jì)算出來的Ct值差距和真實(shí)的是有出入的。 同樣，混采帶來的另一個(gè)隱患是其中的一個(gè)或幾個(gè)樣本即使因采樣不到位，也不會被監(jiān)測出來，道理同上面介紹的混檢。 不管是混采還是混檢，一旦做出陽性，灰區(qū)或單個(gè)靶標(biāo)陽性，立即通知相關(guān)部門對該混采管的20個(gè)受試者暫時(shí)單獨(dú)隔離，并重新采集單管拭子進(jìn)行復(fù)核。 核酸單采、混采對結(jié)果的影響不能一概而論，而要根據(jù)具體情況來分析。 如果對于混采樣本里僅有1個(gè)弱陽性的樣本，可能會引起漏檢，但要注意的是目前口碑良好的核酸檢測試劑，其靈敏度可以達(dá)到200拷貝數(shù)/mL，甚至更低。其實(shí)，與其擔(dān)心混采帶來的敏感性下降而造成漏檢風(fēng)險(xiǎn)還不如選擇一款靈敏度高、性能穩(wěn)定的試劑更為放心！ 【參考文獻(xiàn)】 [1] 國務(wù)院應(yīng)對新型冠狀病毒肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制醫(yī)療救治組關(guān)于印發(fā)新冠病毒核酸10合1混采檢測技術(shù)規(guī)范的通知(2020-08-07). http://www.nhc.gov.cn/yzygj/s7659/202008/fa5057afe4314ef8a9172edd6c65380e.shtml [2] 國務(wù)院應(yīng)對新型冠狀病毒肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制醫(yī)療救治組關(guān)于印發(fā)新冠病毒核酸20合1混采檢測技術(shù)規(guī)范的通知(2022-01-15). http://www.nhc.gov.cn/yzygj/s7659/202201/4644a41bc9c14c5d888ca7c9e1f2f083.shtml [3] 張文婷，劉丹，謝朝軍，等. 廣州市新型冠狀病毒肺炎病例密切接觸者核酸檢測靈敏度和特異度分析. 中華流行病學(xué)雜志，2021, 42(8): 1347-1352 |
