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微生物藥敏檢測(cè)太慢如何破局？國外專家論文提出全新解決方案

轉(zhuǎn)載自檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)網(wǎng) 2023-05-19 15:00

全自動(dòng)微生物質(zhì)譜自上市以來，已成為眾多醫(yī)療機(jī)構(gòu)微生物實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)配置，且每年還有接近400臺(tái)的微生物質(zhì)譜在更多醫(yī)療機(jī)構(gòu)裝機(jī)。作為微生物快速鑒定的一把利器，臨床鑒定速度“慢”的痛點(diǎn)已經(jīng)被質(zhì)譜所解決；但快速藥敏特別是高致病病原體、高耐藥病原體的快速藥敏/耐藥表型檢測(cè)仍然面臨挑戰(zhàn)，是臨床和微生物實(shí)驗(yàn)室的下一個(gè)探索方向。

近日，意大利班比諾格蘇兒科醫(yī)院Gianluca Foglietta等專家在《Frontiers in Microbiology》（影響因子：6.064/中科院JCR分區(qū)：2區(qū)）上發(fā)表了一篇文章：“CORE” a new assay for rapid identification of Klebsiella pneumoniae COlistin REsistant strains by MALDI-TOF MS in positive-ion mode。該文章詳細(xì)闡述了一種新的方法學(xué)，基于正離子模式下MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)肺炎克雷伯菌粘菌素耐藥表型的快速鑒定，內(nèi)容如下：

背景

由于泛耐藥微生物在全球的傳播，粘菌素是公認(rèn)的 MDR 和 XDR 細(xì)菌感染患者挽救治療的抗生素之一。全球范圍內(nèi)已在革蘭氏陰性菌（如腸桿菌科）中發(fā)現(xiàn)粘菌素耐藥菌株，尤其是肺炎克雷伯菌，這與發(fā)病率和死亡率增加密切相關(guān)。

本研究中，開發(fā)并評(píng)價(jià)了一種新的正離子模式 MALDI-TOF MS 測(cè)定方法，該方法使用“Autof MS 1000”質(zhì)譜儀在3h內(nèi)定量或定性區(qū)分粘菌素敏感或耐藥肺炎克雷伯菌株。

如果將此方法整合到微生物診斷工作流程中，有助于抗菌藥物管理和控制肺炎克雷伯菌粘菌素耐藥分離株的院感傳播。

目的

開發(fā)和驗(yàn)證“CORE”檢測(cè)法，該方法是一種在正離子模式下快速檢測(cè)肺炎克雷伯菌對(duì)粘菌素耐藥表型的新型MALDI-TOF方法。使用 Autof MS 1000 質(zhì)譜儀 (Autobio) 檢測(cè)不同濃度粘菌素處理后的肺炎克雷伯菌株，得到評(píng)分＜或≥6，報(bào)告MIC值；通過比較質(zhì)譜結(jié)果與BMD AST結(jié)果，評(píng)價(jià)該測(cè)定法作為MIC預(yù)測(cè)方法和粘菌素耐藥表型篩查工具是否合理（分別為定量和定性AST）。

方法與步驟

標(biāo)本類型

50株粘菌素耐藥(n=32)和敏感(n=18)肺炎克雷伯菌分離株。

藥敏試驗(yàn)

由 Liofilchem™ComASP™粘菌素測(cè)試組(Liofilchem,Roseto degli Abruzzi,Te,Italy)使用 BMD 方法對(duì)臨床分離株進(jìn)行粘菌素敏感性試驗(yàn)，該方法含有27倍稀釋 (0.25–16mg/L) 的抗生素。根據(jù) EUCAST 臨床折點(diǎn) (V12.0，2022) 判讀 MIC 結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 使用PCR方法測(cè)定肺炎克雷伯菌mcr基因的缺失或者突變情況；

2. 將所有肺炎克雷伯菌菌株在麥康凱瓊脂平板 (bioMérieux) 上于37℃下傳代培養(yǎng)24h；使用生長的菌落制備0.5McF菌懸液。除接種量外，按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行 ComASP(Compact Antimicrobial Susceptibility Panel) 粘菌素試驗(yàn)。

3. 在37℃下孵育3h后，取1μL菌懸液點(diǎn)樣至靶板，干燥后，滴加裂解液和基質(zhì)溶液，干燥后在Autof 1000 MS上使用“微生物”自動(dòng)采集模式進(jìn)行校準(zhǔn)和鑒定。

4. CORE數(shù)據(jù)分析

A定性分析：根據(jù)以下參數(shù)將檢測(cè)標(biāo)本歸類為耐藥（colR）或敏感（colS）：MALDI-TOF MS評(píng)分<6.0=S，≥6.0=R。

B定量分析：在0.25–16mg/L范圍內(nèi)獲得的所有質(zhì)譜評(píng)分與對(duì)照組質(zhì)譜評(píng)分一起納入分析中。MIC值確定為質(zhì)譜評(píng)分<6的最低藥物稀釋度。報(bào)告所有樣本的平均值 (G mean) 和根據(jù)重復(fù)樣本計(jì)算的模態(tài)MIC。如果是16mg/L質(zhì)譜評(píng)分>6，報(bào)告MIC值>16mg/L，測(cè)試樣本歸類為colR。相反，在0.25mg/L質(zhì)譜評(píng)分<6的情況下，報(bào)告MIC值<0.25mg/L，并將樣品歸類為colS。

根據(jù)上述定性或定量CORE試驗(yàn)的算法對(duì)每種菌株進(jìn)行分類。在使用粘菌素的EUCAST臨床折點(diǎn) (V12.0，2022) 進(jìn)行解釋后，將結(jié)果與常規(guī)BMD試驗(yàn)獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。

結(jié)果

通過 MALDI-TOF MS 分析的簡單算法（MALDI-TOF MS評(píng)分<6.0=或≥6.0=R），定性 CORE 測(cè)定結(jié)果和樣本表型總體一致，CA（分類一致性）=100%。此外，在 colR 和 colS 分離株的定量 CORE 試驗(yàn)中， EA（基本一致性）分別達(dá)到93.7%和83.3%。

根據(jù)本次50例肺炎克雷伯菌分離株的 PCR檢測(cè)、BMD試驗(yàn)、MALDI-TOF MS 鑒定的結(jié)果進(jìn)行 CORE 分析，可在3h內(nèi)為臨床醫(yī)生提供藥敏結(jié)果，而無需等待常規(guī) BMD 分析所需的16-24h。此外，使用 MALDI-TOF 在正離子模式下獲得粘菌素耐藥表型檢測(cè)的可能性，無需切換到負(fù)離子模式，既避免了校準(zhǔn)步驟，又驗(yàn)證了 CORE 方法適用于當(dāng)前常規(guī)的 MALDI-TOF MS 鑒定工作流程。

綜上所述，全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)不僅廣泛應(yīng)用于微生物鑒定，而且可以實(shí)現(xiàn)快速鑒定肺炎克雷伯菌粘菌素耐藥/敏感菌株！為進(jìn)一步擴(kuò)大 MALDI-TOF MS 在快速藥敏檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了依據(jù)；為高致病病原體、高耐藥病原體的快速藥敏/耐藥表型檢測(cè)拓展了新的方向！

全自動(dòng)微生物質(zhì)譜不僅用于粘菌素耐藥表型的快速檢測(cè)！同時(shí)可檢測(cè)MRSA、ESBLs、CRE、CRAB、CRPA、VRE等耐藥表型，及各種酶型如KPC、OXA、NDM、VIM等；助力細(xì)菌耐藥防控！