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臨床實(shí)驗(yàn)室核酸污染處理方法的研究作者：陳歡1 張曉迪2 洪浩然3 2. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），菏澤分院，山東省生物工程技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 菏澤 274000 3. 菏澤德康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，山東 菏澤 274000 摘 要：本文以新型冠狀病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室為例，探討了75%酒精、新型核酸清洗液以及含氯溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)室各種污染源、污染方式的清除效果。結(jié)果顯示，酒精及含氯溶液對(duì)于污染的清除效果較弱，使用核酸清洗液可以有效的清除各類污染，且核酸清洗液沒(méi)有含氯溶液腐蝕性的缺點(diǎn)，是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室較為理想的污染處理方法。 關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；新型冠狀病毒；污染；核酸清洗液 2019年末，新型冠狀病毒2019-nCoV被首次發(fā)現(xiàn)感染人類，隨后2020年新冠疫情在全球爆發(fā)。在疫情防控方面，新型冠狀病毒核酸檢測(cè)是發(fā)現(xiàn)、確診感染病例的有效手段。近兩年來(lái)，隨著疫情防控不斷升級(jí)，全國(guó)各地建立了一大批分子生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，有效緩解了核酸檢測(cè)壓力。但是，由于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)轉(zhuǎn)、強(qiáng)陽(yáng)性樣本氣溶膠污染、操作員操作不規(guī)范等各種原因，實(shí)驗(yàn)室污染的現(xiàn)象頻頻發(fā)生。實(shí)驗(yàn)室發(fā)生污染以后，輕則重新進(jìn)行檢測(cè)，重則實(shí)驗(yàn)室停止運(yùn)轉(zhuǎn)，必須等污染消除后才能繼續(xù)使用。因此，亟需尋找一種有效的去除分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室核酸污染方法。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種用于放大擴(kuò)增特定的核酸片段的分子生物學(xué)技術(shù)，該技術(shù)于1985年被美國(guó)Kary Mullis等人發(fā)明[1]。PCR具有靈敏度高、簡(jiǎn)單快速、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，在新型冠狀病毒檢測(cè)方面，相較于抗原檢測(cè)，PCR檢測(cè)具有提前發(fā)現(xiàn)感染者、準(zhǔn)確度高的巨大優(yōu)勢(shì)，因此，PCR檢測(cè)是新型冠狀病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。由于PCR技術(shù)的靈敏度極高[3]，一旦發(fā)生實(shí)驗(yàn)室污染，就會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的發(fā)生，這對(duì)于分子生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)是及其致命的。一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的污染來(lái)源于以下幾個(gè)方面：第一，強(qiáng)陽(yáng)性樣本氣溶膠污染；第二，檢測(cè)試劑盒內(nèi)陽(yáng)性質(zhì)控品污染；第三，PCR產(chǎn)物氣溶膠污染[4]。目前，處理實(shí)驗(yàn)室污染，一般采用含氯消毒劑噴灑、酒精擦拭和紫外燈照射處理的方法[5]，但是，含氯消毒劑具有較強(qiáng)的腐蝕性，不能處理儀器設(shè)備，酒精又有發(fā)生火災(zāi)的隱患，紫外照射只能將長(zhǎng)片段核酸降解成短片段，不能完全降解核酸，對(duì)于長(zhǎng)度為100~200 bp的PCR產(chǎn)物污染，紫外照射的效果收效甚微。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比75%酒精、新型核酸清洗液以及含氯溶液處理的方法，評(píng)估各處理方法對(duì)試劑盒陽(yáng)性對(duì)照、PCR產(chǎn)物的清除效果，以期為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的污染處理提供新的有效方法。 1.1試劑與儀器主要試劑與儀器見(jiàn)表1。
表1主要試劑與儀器及廠家 1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1不同處理方法對(duì)核酸處理效果檢測(cè)使用核酸提取或純化試劑提取核酸檢測(cè)試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照，并按照說(shuō)明書(shū)要求將陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物于產(chǎn)物分析室稀釋10000倍備用。 使用核酸提取或純化試劑將核酸檢測(cè)試劑盒陽(yáng)性對(duì)照、稀釋后的PCR產(chǎn)物純化為核酸溶液，各取10 μL于1.5 mL離心管中，分別加入200 μL TE Buffer(對(duì)照組)、濃度為2000 mg/L的含氯溶液(實(shí)驗(yàn)組1)、75%酒精(實(shí)驗(yàn)組2)和核酸清洗液(實(shí)驗(yàn)組3)，混勻后室溫反應(yīng)15 min，隨后使用核酸提取或純化試劑純化為待檢樣本，用于下一步PCR檢測(cè)。 根據(jù)核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，取待測(cè)樣本20 μL加入至20 μL反應(yīng)液中，體積共40 μL，按照說(shuō)明書(shū)反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 1.2.2核酸清洗液噴灑對(duì)核酸處理效果檢測(cè)使用核酸提取或純化試劑提取核酸檢測(cè)試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照，并按照說(shuō)明書(shū)要求將陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物于產(chǎn)物分析室稀釋10000倍備用。 使用核酸提取或純化試劑將核酸檢測(cè)試劑盒陽(yáng)性對(duì)照、稀釋后的PCR產(chǎn)物純化為核酸溶液，各取10 μL滴于咽拭子上，將咽拭子固定并放置于實(shí)驗(yàn)室傳遞窗內(nèi)，使用噴壺對(duì)準(zhǔn)拭子噴灑TE Buffer(對(duì)照組)或核酸清洗液(實(shí)驗(yàn)組)，15 min后將拭子取出，置于TE Buffer內(nèi)，劇烈震蕩使拭子附著物溶于TE Buffer內(nèi)，隨后將TE Buffer添加至核酸提取或純化試劑進(jìn)行核酸提取純化為待檢樣本，用于下一步PCR檢測(cè)。 2.1不同處理方法對(duì)核酸處理效果檢測(cè)通過(guò)不同處理方法對(duì)陽(yáng)性對(duì)照和PCR產(chǎn)物處理后，核酸純化并進(jìn)行檢測(cè)。 如圖1(a)所示，陽(yáng)性對(duì)照ORF1ab基因片段經(jīng)處理后，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2均出現(xiàn)了擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)組3無(wú)擴(kuò)增。同時(shí)，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2的CT值相差不大；如圖1(b)所示，陽(yáng)性對(duì)照N基因片段被不同方式處理后，表現(xiàn)出與ORF1ab基因同樣的效果。結(jié)果表明，含氯溶液和75%酒精在短時(shí)間內(nèi)對(duì)于RNA的降解是有限的，而核酸清洗液可以有效地去除陽(yáng)性對(duì)照中的RNA片段。
圖1. 陽(yáng)性對(duì)照不同方式處理后檢測(cè)結(jié)果 如圖2(a)所示，PCR產(chǎn)物中ORF1ab基因產(chǎn)物片段經(jīng)處理后，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2均出現(xiàn)了擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)組3無(wú)擴(kuò)增。同時(shí)，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2的CT值相差不大；如圖2(b)所示，PCR產(chǎn)物N基因產(chǎn)物片段被不同方式處理后，表現(xiàn)出與ORF1ab基因同樣的效果。結(jié)果表明，含氯溶液和75%酒精在短時(shí)間內(nèi)對(duì)于DNA的降解是有限的，而核酸清洗液可以有效地去除PCR產(chǎn)物中的DNA片段。 圖2. PCR產(chǎn)物不同方式處理后檢測(cè)結(jié)果 2.2核酸清洗液噴灑對(duì)核酸處理效果檢測(cè)通過(guò)噴灑不同液體對(duì)陽(yáng)性對(duì)照和PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理，隨后核酸純化并進(jìn)行檢測(cè)。 如圖3(a)所示，陽(yáng)性對(duì)照ORF1ab基因片段經(jīng)處理后，對(duì)照組有明顯擴(kuò)增，而實(shí)驗(yàn)組無(wú)擴(kuò)增曲線；同樣的，如3(b)所示，N基因經(jīng)處理后有同樣的表現(xiàn)。這說(shuō)明核酸清洗液通過(guò)噴灑的方式可以達(dá)到消除RNA污染的目的。
圖3. 陽(yáng)性對(duì)照經(jīng)核酸清洗液噴灑后的檢測(cè)結(jié)果 如圖4(a)所示，PCR產(chǎn)物ORF1ab基因產(chǎn)物片段經(jīng)處理后，對(duì)照組有明顯擴(kuò)增，而實(shí)驗(yàn)組無(wú)擴(kuò)增曲線；同樣的，如4(b)所示，N基因產(chǎn)物片段經(jīng)處理后有同樣的表現(xiàn)。這說(shuō)明核酸清洗液通過(guò)噴灑的方式可以達(dá)到消除DNA污染的目的。
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