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作者：黃進 陳劉俊 單位：武漢市第四醫(yī)院檢驗科 新型冠狀病毒感染引起的肺炎疫情至今仍在全球肆虐，且感染病例數(shù)在突破2000萬后仍在繼續(xù)攀升。經(jīng)過全國上下艱苦努力，我國新冠肺炎疫情防控向好態(tài)勢進一步鞏固，為全面落實“外防輸入、內(nèi)防反彈”的總體防控策略，防控工作已從應(yīng)急狀態(tài)轉(zhuǎn)為常態(tài)化。 隨著各地新建符合安全級別的PCR實驗室與核酸檢測技術(shù)的普及，病毒核酸檢測常態(tài)化已成為落實疫情常態(tài)化防控“四早要求”的首要措施與關(guān)鍵舉措。 當遇到標本采集的質(zhì)量、患者所處的病程及檢測試劑盒的靈敏度等因素可影響檢酸檢測結(jié)果。樣本采樣部位不佳、采樣量不足、保存不當、病程早期病毒分泌量少及檢測試劑靈敏度不佳常導致新冠病毒核酸檢測的假陰性結(jié)果。 但隨著大批量臨床樣本的實驗室檢測不斷增多，除了此前多篇報道的“核酸檢測可能存在假陰性”外，“假陽性”也是一個不容忽視的問題。 為什么會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果？如何判斷檢測結(jié)果是假陽性？我們應(yīng)該如何盡量降低或避免假陽性結(jié)果，保證核酸檢測結(jié)果的準確性呢？出現(xiàn)了假陽性該怎么辦？...... 要知道以上“假陽性”的相關(guān)問題，我們可能要從PCR技術(shù)的原理聊起。 首先給大家介紹一下臨床上用于新型冠狀病毒核酸檢測的實時熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)，也就是人們常說的PCR。 實時熒光RT（real-time）-PCR，即實時熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)。它首先將提取的病毒基因組RNA，通過反轉(zhuǎn)錄變成DNA（cDNA）。然后再用病原體特異性的引物，以cDNA作為模板擴增病原體核酸序列。因為擴增的過程中熒光染料能同步整合在產(chǎn)物上，所以研究者可以通過熒光信號的強弱，進行實時檢測。 武漢市第四醫(yī)院檢驗科核酸檢測PCR擴增 實時熒光RT-PCR技術(shù)具有特異、快速、敏感、產(chǎn)率高、高通量、簡便等突出優(yōu)點，為人類疾病的防治提供新的檢測手段，已成為臨床實驗室常用的操作技術(shù)之一。大多數(shù)病原體都可通過PCR檢測，除了新冠病毒外，還有乙肝病毒（HBV）、人乳頭瘤病毒（HPV）等，但在實際PCR實驗過程中極易發(fā)生污染，引起檢測結(jié)果的假陽性。 PCR反應(yīng)的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但作為一種高靈敏度的檢測手段，也是因為過于靈敏反而容易污染，PCR的實驗結(jié)果也容易被各種無關(guān)的外源性DNA或RNA所干擾，極其微量的污染也能擴增后被檢出，即在本不該出現(xiàn)熒光信號的陰性樣本、陰性對照（生理鹽水）或空白對照中出現(xiàn)了陽性的熒光信號，可能造成假陽性的產(chǎn)生與陽性結(jié)果誤判。 由于PCR技術(shù)敏感性特高，所以要求更高，影響因素也非常多，從樣品開始采集到結(jié)果報告發(fā)出，任何一處細小的失誤都會造成檢測結(jié)果的偏差，極其微量的污染都容易導致樣品出現(xiàn)假陽性結(jié)果。產(chǎn)生污染的主要途徑如下： 1、標本的污染 （1） 收集標本的容器被污染； （2） 標本放置的時候，由于密封不嚴溢于容器外； （3） 容器外粘有標本造成相互間交叉污染； （4） 標本核酸模板在提取過程中，由于加樣器污染導致標本間污染； （5） 有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。
武漢市第四醫(yī)院檢驗科正在進行核酸提取加樣 2、試劑的污染 主要是在PCR組分試劑配制加樣過程中，由于加樣器、容器、雙蒸水、陰性對照及其它試劑被PCR核酸模板或陽性對照污染。 3、擴增產(chǎn)物污染 實驗室擴增產(chǎn)物的遺留污染是PCR實驗室中最主要、最常見的污染。因為 PCR 產(chǎn)物拷貝量大，遠遠高于 PCR 檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。 氣溶膠污染是最可能造成PCR產(chǎn)物污染的主要原因。在離心機離心、空氣與液體面摩擦時、在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時、閉蓋時，及污染加樣器的反復吸樣吹打都可形成氣溶膠而污染。當這些氣溶膠里長短不一核酸片段的小顆粒在實驗室里（或移液器內(nèi)）日積月累，沉降到實驗臺面、PCR儀、移液器、吸頭盒等地方，當達到一定濃度，很可能會彌漫到樣本中，最后導致PCR實驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性。 根據(jù)國務(wù)院應(yīng)對新型冠狀病毒肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機制醫(yī)療救治組2020年7月10日發(fā)布的《醫(yī)療機構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊》，PCR實驗室的污染應(yīng)急處理方法如下： 1、標本污染生物安全柜的操作臺造成局限污染時 立即用吸水紙覆蓋，并使用0.55%含氯消毒劑進行噴灑消毒。消毒液需要現(xiàn)用現(xiàn)配，24小時內(nèi)使用。 2、標本傾覆造成實驗室污染時 保持實驗室空間密閉，避免污染物擴散。立即使用潤濕有0.55%含氯消毒劑的毛巾覆蓋污染區(qū)。必要時（如大量溢撒時）可用過氧乙酸加熱熏蒸實驗室，劑量為2g/m3，熏蒸過夜；或20g/L過氧乙酸消毒液用氣溶膠噴霧器噴霧，用量8ml/m3，作用1-2小時；必要時或用高錳酸鉀-甲醛熏蒸：高錳酸鉀8g/m3，放入耐熱耐腐蝕容器（陶罐或玻璃容器），后加入甲醛（40%）10ml/m3，熏蒸4小時以上。熏蒸時室內(nèi)濕度60%-80%。 3、清理污染物時嚴格遵循活病毒生物安全操作要求 采用壓力蒸汽滅菌處理，并進行實驗室換氣等，防止次生危害。 1．布局合理的實驗室是保證實驗?zāi)苷＿M行的前提 PCR實驗室原則上至少設(shè)有試劑準備區(qū)、樣品制備區(qū)，擴增區(qū)三個單獨的工作區(qū)域，并設(shè)有專用走廊，各工作區(qū)域應(yīng)設(shè)緩沖間。各區(qū)在空間上完全獨立，不能相通。各區(qū)有獨立的通風系統(tǒng)，擴增前和擴增后區(qū)域應(yīng)具有獨立通風系統(tǒng)，擴增后區(qū)域保持負壓狀態(tài)，其它區(qū)域保持正壓或常壓狀態(tài)，防止擴增產(chǎn)物進入擴增前的區(qū)域，壓差≥5Pa。進風口和出風口不能設(shè)在建筑的同一平面，要避免排出的空氣被重新吸進實驗室。 各區(qū)域只用于特定的操作，工作衣和清潔清毒物品不得跨區(qū)混用，實驗室人員和物品應(yīng)從試劑準備區(qū)到擴增區(qū)單向工作流動，不得逆向流動。
某醫(yī)院PCR實驗室平面圖設(shè)置 2．做好質(zhì)量控制 實驗室應(yīng)建立合理、科學的室內(nèi)質(zhì)控標準操作規(guī)程（SOP），質(zhì)控應(yīng)該樣本處理到報告發(fā)放全程參與，新型冠狀病毒核酸檢測嚴格執(zhí)行“三個陰性樣本隨機放在臨床標本中間同時參與檢測全過程”的質(zhì)控策略，以及復檢規(guī)則的設(shè)置等，可有效避免假陽性結(jié)果的發(fā)生[1]。 3. 試劑耗材的擺放 配制試劑時應(yīng)正確使用加樣槍，使用帶濾心的槍頭，盡量一次性吸完，不要反復多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠。核酸提取結(jié)束后，取下廢棄試劑和耗材，用自封袋密封后放入醫(yī)療廢物桶中。 帶濾心的槍頭 4. 核酸擴增 擴增產(chǎn)物是最容易出現(xiàn)的污染，通常一次典型的PCR擴增可以產(chǎn)生109拷貝的靶序列，若氣溶膠化，最小的氣溶膠都會產(chǎn)生含106拷貝的擴增序列，這些氣溶膠的累積會污染實驗室內(nèi)的試劑、儀器設(shè)備和通風設(shè)備，使檢測結(jié)果出現(xiàn)異常[2]。因此，應(yīng)對核酸擴增的每一個環(huán)節(jié)進行嚴格的規(guī)范操作。 （1）擴增反應(yīng)液和樣本核酸模板分裝完畢檢查管內(nèi)液面高度一致后，加蓋八聯(lián)管蓋，逐孔按緊，混勻離心后再次檢查八聯(lián)管有無滲漏。 （2）八聯(lián)管轉(zhuǎn)移至96孔擴增盤時再次確認管蓋已封嚴，以防擴增過程中爆管導致實驗室污染。
將擴增產(chǎn)物八聯(lián)管放入“自封袋”內(nèi)封嚴 （3）擴增結(jié)束后要及時將擴增產(chǎn)物從擴增儀里取出（禁止打開八聯(lián)管），檢查管內(nèi)液面無變化后放入“自封袋”內(nèi)封嚴，然后帶出擴增區(qū)，不能隨便丟棄，需按醫(yī)療廢物處理。 5．實驗結(jié)束后的清潔消毒 清潔消毒方法不當也是實驗室污染的一個主要原因，實驗結(jié)束后應(yīng)遵從先清潔區(qū)域后污染區(qū)域消毒的原則，及時對實驗室空氣、設(shè)備表面、工作臺面和地面等實施有效的消毒。 （1）紫外燈 工作結(jié)束后用可移動紫外線燈進行工作臺面照射； 開啟超凈工作臺或生物安全柜內(nèi)的紫外線進行照射； 夜間開啟固定紫外線燈進行照射。
武漢市第四醫(yī)院檢驗科核酸提取完照紫外消毒 （2）70%乙醇 每天工作開始前及工作結(jié)束后拭工作臺面、設(shè)備及物品表面； 日常儀器和架子的維護清潔。 （3）0.55%次氯酸鈉溶液（新鮮配置） 實驗室工作臺面和樣本外濺時使用； 開蓋機、生物安全柜等日常擦拭。 （4）PCR Cleaner（ PCR污染清除噴霧劑） PCR Cleaner（ PCR污染清除噴霧劑）是去除實驗室操作臺表面DNA的即用型噴霧劑，用于去除PCR工作臺、實驗室機電產(chǎn)品、試驗臺表面和實驗儀器設(shè)備表面上殘存的核酸，能快速有效地清除DNA或RNA污染，也是PCR實驗室常見的污染清除利器之一。 另外，加強實驗室通風，真的非常重要！�。。�！ 總結(jié)下來， 實驗室防污染原則 預防為主，嚴守章程！ 細節(jié)決定成敗，尤其對于實驗環(huán)境和操作要求極高的核酸實驗室，任何一個環(huán)節(jié)做不好都可能影響整個實驗結(jié)果。我們所有檢驗人員只有把防污染思想貫徹于整個實驗過程中，才能有效避免假陽性的產(chǎn)生，保證準確的核酸檢測結(jié)果。 【參考文獻】 1. 張瑞，李金明. 如何減少新型冠狀病毒核酸檢測的“假陰性”。中華檢驗醫(yī)學雜志，2020年第11期述評。 2. 倪沈陽，石巍，陳琬玥，等. 溫度對氣溶膠濃度影響的模擬研究[J]. 吉林建筑大學學報，2016，33（6）：53-56. 3. 國務(wù)院應(yīng)對新型冠狀病毒肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機制醫(yī)療救治組. 《醫(yī)療機構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊》. 2020. 本文轉(zhuǎn)載自檢驗醫(yī)學網(wǎng) |
