作者：樊東東1 陳芊如1 王楠1 蘇世圣1 彭衍科1 王芳2 劉寶霞2 王博2 白宇2 盧臨萍2 祝令香2 楊文軍2 郭永1單位：1.清華大學醫(yī)學院生物醫(yī)學工程系，2.北京新羿生物科技有限公司
2019年12月出現(xiàn)了一種新型的冠狀病毒，該病毒具備極高的傳染性和隱匿性，這使其在全球范圍內迅速擴散，迄今已經有約1.5億人被感染，超過300萬人喪失生命。在疫情防控、感染確診和臨床治療中，以PCR為代表的分子診斷技術發(fā)揮了巨大的作用，特別是在疫情初篩階段，更是發(fā)揮了保障社會正常運轉的作用。在PCR領域，數字PCR（dPCR）是一種新興的PCR檢測技術，具備絕對定量、靈敏度高、特異性好、抗干擾能力強等諸多優(yōu)點。本文首先介紹了基于微液滴技術的dPCR的技術原理、檢測的過程、以及微液滴技術賦予dPCR的優(yōu)勢�；诖�，本文回顧了dPCR在新冠疫情中的研究進展。比如，基于絕對定量的能力可以研究樣本類型中新冠病毒的含量、評估樣本制備方法對病毒檢出率的影響、進行新冠新藥的臨床評估；基于高靈敏性可用于低豐度病毒樣本的檢測、用于檢測灰區(qū)的甄別等。隨著研發(fā)的深入，dPCR的應用前景比較廣闊。
2019年12月爆發(fā)了一種由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的傳染病1，該疾病已經在全球范圍內持續(xù)流行了18個月之久。SARS-CoV-2與中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）、蝙蝠SARS樣冠狀病毒（SARS-like bat CoV）和嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）同屬乙型冠狀病毒支系，基因組分析發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2與SARS-like bat CoV最為相近2。SARS-CoV-2基因組編碼29個蛋白，其中結構蛋白由4個結構基因編碼，包括尖峰（S）、包膜（E）、膜（M）和核蓋體（N）基因；而非結構蛋白主要由ORF1ab基因編碼2。由此病原體引發(fā)的傳染病被命名為新型冠狀病毒肺炎（COVID-19），COVID-19疫情影響全世界，截至2021年4月29日，約1.5億人染病、超過300萬人死亡 (https://coronavirus.jhu.edu/map.html)。COVID-19的傳染性極強，及時、準確的診斷對于治療和疫情防控十分重要。當前主要以病毒RNA檢測作為確診COVID-19的方法，臨床上應用最多的技術為實時熒光逆轉錄PCR（RT-qPCR）3。其他一些核酸檢測技術也被開發(fā)用于SARS-CoV-2的檢測，包括數字PCR（dPCR）、環(huán)介導逆轉錄等溫擴增技術（RT-LAMP）、轉錄介導擴增技術（TMA）等4。其中，dPCR是繼實時熒光定量PCR（qPCR）之后新發(fā)展起來的一種核酸定量分析技術，dPCR的具備高靈敏度、高精度和絕對定量等獨特優(yōu)勢，在新冠疫情中被用于病毒的檢測、定量、病情監(jiān)測、新藥評估等多種研究。本文將對dPCR的技術原理和優(yōu)勢進行介紹，回顧dPCR在新冠疫情中的應用，并嘗試為dPCR在新冠疫情與相關臨床應用中的改進和發(fā)展方向提出見解。
1. 數字PCR技術原理：dPCR的原理是將PCR的反應體系離散為眾多微小單元，然后通過對微小單元內反應結果的檢測反映整個體系的原始模板拷貝數目。通常來說，dPCR包括微液滴式和微孔式，微液滴dPCR采用基于微流控的液滴技術離散整個反應單元5；微孔式dPCR主要采用微納米加工技術將一片基材加工成包含數萬個微反應室以實現(xiàn)反應單元的離散6。以微液滴dPCR的SARS-CoV-2檢測為例，圖1展示了dPCR的技術原理和檢測程序。首先是配制含有靶標檢測引物和探針的混合液，通常使用特異性的TaqMan探針或者是非特異性的染色法標記技術，在SARS-CoV-2檢測中多使用TaqMan法，以N基因和ORF1ab基因作為靶點。然后采用微流控芯片生成微液滴，液滴直徑通常在90-120 μm，微液滴生成有十字法和T型通道法等，目前采用最多的是十字法，見圖1b。生成的液滴存在三種狀態(tài)：不含靶標核酸分子、含有單個靶標核酸分子、含有多個靶標核酸分子，在靶標分子豐度不高的情況下，液滴處于以上三種狀態(tài)的概率遵從泊松分布。液滴后續(xù)被放置到熱循環(huán)儀上進行擴增，這一步驟和普通PCR過程基本一致。經過擴增之后，原包含有靶標核酸分子的液滴內部的核酸量將達到百億量級，靶標分子在擴增的過程中和熒光基團結合，使其能接受光信號的激發(fā)并釋放熒光信號。之后，液滴將逐個通過光學檢測位，不包含靶標分子的液滴的被激發(fā)光信號較弱，包含有熒光靶標分子的被激發(fā)光信號較強，見圖1e。光信號通過一些例如放大、聚焦、過濾等的處理操作后被光電倍增管（PMT）轉換為電信號，每一個液滴對應一個或多個信號峰值，峰值的高低和頻段反映了液滴的狀態(tài)。最終液滴的統(tǒng)計信息根據泊松分布轉化為原始靶標分子的濃度，圖1f展示了雙重靶標dPCR的分析結果，圖中散點的位置代表了攜帶不同靶標的液滴。
2. 數字PCR優(yōu)勢：絕對定量：qPCR通過計算擴增過程的熒光曲線的Ct值，并配合參考品同時擴增建立的標準曲線，對待測樣本進行定量，而熒光曲線往往容易受到擴增效率、抑制劑、樣本質量、系統(tǒng)誤差等因素影響。與qPCR不同，dPCR將待測靶分子分散在數萬甚至數百萬反應單元中，并根據每個反應單元擴增反應終點的熒光強度進行陰陽性劃分。dPCR的拷貝數計算依據陰陽性反應單元的數量和統(tǒng)計學模型，可對靶分子的數量實現(xiàn)精準的絕對定量，不容易受干擾，也不依賴于參考品。因此，dPCR能夠提供更可靠和準確的定量結果。Hindson等人比較了dPCR與qPCR定量miRNA的能力，結果顯示dPCR能夠提供比qPCR更精確和更高重復性的定量結果7。更高的靈敏度：dPCR技術對整個反應體系進行萬倍以上的離散，由于背景模板被大量的反應單元所分割和稀釋，在含有目標模板的反應單元中，背景模板的數量呈數量級減少（比如將PCR體系分割為10000個反應單元，則每個反應單元內的背景模板的數量被減少4個數量級），因此PCR擴增時目標模板受到的非特異性干擾也呈數量級地減少，從而保證目標模板的特異擴增。因此dPCR能提供更高的靈敏度，使得在大量背景模板的干擾下對稀有靶標檢測變得可能。如在BRAF V600E稀有突變的檢測中，dPCR和qPCR分別能夠檢測到0.001%和約1%的突變比例8。更好的穩(wěn)定性：較大數量級的離散使得原先在反應體系中存在的一些抑制劑也被分散至各個微反應單元中，此舉大大減少了每個反應單元內的抑制劑總量，使得dPCR對抑制劑的抗性增強。在一些病毒（如巨細胞病毒）檢測體系中，即便抑制劑可以影響PCR的擴增，但是影響程度相對qPCR較小，并且受影響的液滴也仍然可以通過比對其熒光信號強度與陽性信號閾值進行正確判定9, 10。更高的精度：dPCR的定量原理決定了其比qPCR具有更高的定量精度。在qPCR中，由于熒光信號在每個循環(huán)中都會加倍，因此一次檢測通常只能解析兩倍的拷貝數差異；在dPCR中，通過將反應體系進行離散以及檢測擴增反應后每個反應單元的熒光信號，理論上可以達到定量單個分子的效果�？梢酝ㄟ^將反應體系分割為更多反應單元來提高精度。例如在人類巨細胞病毒的定量檢測研究中，結果顯示dPCR的定量變異系數小于qPCR的，在10000拷貝/mL和1000拷貝/mL的水平dPCR的變異系數較qPCR的分別減少4倍和1.5倍11。
1. 高靈敏度新冠核酸檢測：RT-qPCR雖然是目前COVID-19診斷的金標準，但其被報道存在假陰性率高的問題12, 13。假陰性結果可能由多種因素造成，包括引物和探針靶區(qū)域突變、樣本中的病毒量不足、采樣過程不規(guī)范、運輸不當和樣本中存在擴增抑制劑等14。由于dPCR技術具有高靈敏度和較好的抑制劑抗性的特性，其應用于檢測SARS-CoV-2時能夠有效的減少假陰性結果。研究人員比較了基于dPCR和RT-qPCR的SARS-CoV-2檢測方法的最低檢測限（LoD），結果表明dPCR的方法具有更低的LoD和更高的靈敏度15-17。在臨床樣本的檢測中，dPCR也表現(xiàn)出比RT-qPCR具有更高的靈敏度，部分RT-qPCR檢測為疑似或陰性的COVID-19樣本，dPCR都成功檢測出陽性15, 17-21。在Suo等人15的研究中，26例COVID-19確診患者的樣本被dPCR成功檢出，而這些樣本的RT-qPCR檢測結果均為陰性。此外，F(xiàn)alzone等人16的研究也顯示dPCR對擴增抑制劑的作用較不敏感。由此說明，dPCR在低病毒載量樣本的檢測中具有優(yōu)勢，能夠作為RT-qPCR的補充。2.臨床樣本類型病毒載量評估：COVID-19臨床樣本的取樣部位和類型很多，包括鼻拭子、咽拭子、痰液、血液、尿液、糞便、支氣管肺泡灌洗液等等。選擇合適的臨床樣本有助于進行準確的臨床診斷，對疾病防控和治療有重大意義。因此，有必要評估各個類型的樣本的病毒載量，盡可能選擇病毒載量最多的樣本以提高檢出率。Yu等18使用dPCR定量鼻拭子、咽拭子、痰液、血液、尿液中的病毒載量，結果發(fā)現(xiàn)痰液中具有最高的病毒載量，鼻拭子和咽拭子次之，提示了以痰液作為檢測樣本能夠提高陽性檢出率。但是鼻、咽拭子的樣本都需要專業(yè)的醫(yī)護人員獲取，采樣便利性不及唾液，因此不斷有研究人員驗證唾液檢測病毒的可靠性。Sui等22對35個無癥狀但核酸陽性的病人采取了183份樣本樣類型包括唾液、痰液、鼻咽拭子和口腔拭子，檢測結果顯示唾液的陽性檢出率僅僅比鼻咽拭子略低一點，高于其他類型的樣本，并且相對其他樣本，能夠提供更低的假陰性率。Li等23采用數字PCR對鼻咽拭子、肛周拭子、唾液等不同類型的樣本進行了定量檢測，結果顯示鼻咽拭子能夠提供最高的檢出率，而肛周拭子僅次于鼻咽拭子，檢出率為24.3%，這為新冠病毒檢測的樣本類型提供了一種新的可能。以上研究表明dPCR的絕對定量能力在COVID-19臨床樣本評估、病毒定量中發(fā)揮重要作用。3.樣本制備方法評估：為了保護醫(yī)學實驗室人員免受感染，大多數實驗室在檢測前會對臨床樣本進行滅活處理。然而，滅活處理可能會對檢測帶來影響，導致假陰性結果，因此有必要明確樣本前處理對檢測結果的具體影響。Chen等人24使用dPCR定量3種滅活方法處理前后樣本中的病毒量，結果顯示滅活處理減少了可檢到的病毒量，并可能因此導致假陰性結果，其中熱滅活的樣本中病毒拷貝數大幅下降，使用TRIzol試劑對RNA拷貝數的影響最小。dPCR在核酸樣本滅活處理的評估中發(fā)揮了其絕對定量的優(yōu)勢，同樣的方法能夠用于其他影響因素的研究。4.病情進展動態(tài)監(jiān)測：在臨床管理與治療中需要對患者的病情進展進行監(jiān)測，其中病毒載量通常與病情的嚴重程度相關。Yu等人18利用dPCR定量患者不同時期的樣本中的病毒載量，發(fā)現(xiàn)在早期和進展期的病毒載量明顯高于恢復期的病毒載量，提示動態(tài)監(jiān)測樣本中的病毒載量有助于評估疾病的進展。Szwebel等25發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2核酸病毒血癥可以作為監(jiān)測新冠抗IL6受體治療過程的特異性標志物，因為該療法效果個體差異性較大，因此可以通過dPCR檢測這一標志物來篩選符合條件的患者。這類研究說明dPCR高靈敏度與精確定量的特性使其能夠勝任患者感染病毒后，病情發(fā)展、治療等過程中病毒載量變化的監(jiān)測。5.核酸參考品制備：在 SARS-CoV-2的核酸檢測中，核酸參考品被用于評估檢測方法的性能、制作RT-qPCR定量標準曲線以及作為陽性對照。van Kasteren等人26使用dPCR定量病毒RNA拷貝數并對樣本進行系列稀釋，以系列稀釋液評估不同RT-qPCR試劑盒的檢測靈敏度。Fung等人27通過dPCR定量病毒核酸，制備系列稀釋液，以此測定七種SARS-CoV-2檢測方法的檢測下限。此外，在Hu等人28的研究使用dPCR標定的系列參考品評估單、雙、三靶標的新冠qPCR體系，結論進一步得到了采用經dPCR定值的57分臨床樣本的驗證。dPCR絕對定量的優(yōu)勢使其能夠滿足核酸參考品制備的需求，即對核酸進行精確的定量。對于中檢院和國家計量院制定新冠國家核酸參考品來說，dPCR是一個必不可少的工具，并且發(fā)揮了重要作用；對于從事新冠檢測的企業(yè)制備核酸企業(yè)參考品，也是同樣的重要。6.環(huán)境中SARS-CoV-2監(jiān)測：COVID-19的傳染力強，了解病毒的傳播方式與環(huán)境中病毒的分布，有助于指導疫情防控策略的制定。由于從不同環(huán)境中得到的樣本質量不一，這就對病毒的檢測提出了高靈敏度及強抗抑制劑干擾性的要求。Liu等人29通過dPCR定量COVID-19爆發(fā)期間武漢兩家醫(yī)院不同區(qū)域氣溶膠中的病毒RNA，隔離病房和通風的病房中檢測到的病毒RNA濃度非常低，但在患者使用的洗手間和某些醫(yī)務人員區(qū)域檢測到較高濃度，結果顯示SARS-CoV-2具有通過氣溶膠傳播的潛力。Lv等人30利用RT-qPCR和dPCR檢測樣品運輸和接收設施、測試儀器、個人防護設備等實驗室相關物體表面上殘留的病毒。RT-qPCR檢測結果均為陰性，而dPCR在61個樣品中檢測出13個SARS-CoV-2陽性。SARS-CoV-2核酸密度最高的區(qū)域是操作員的外手套，其余操作員戴著手套的手直接或間接接觸的物體也檢測出病毒，表明手接觸是導致實驗室環(huán)境污染的主要傳播途徑�；赿PCR能夠靈敏檢測與定量環(huán)境中的病毒RNA濃度，由此為防疫措施與消毒程序提供參考依據。7. SARS-CoV-2突變檢測：RNA病毒的突變率非常高，高突變率與毒力調節(jié)和進化能力相關，病毒突變研究對于評估病毒耐藥性、了解免疫逃逸和發(fā)病機理相關的機制至關重要。通過基因測序和比對能夠獲得病毒變異的基因組信息，但要在實驗室樣品與臨床樣品中檢測出已知的SARS-CoV-2遺傳變異則需要靈敏度更高的技術。Wong等人31開發(fā)了一種基于dPCR的檢測方法來檢測Vero-E6傳播的分離株、類器官、實驗感染的倉鼠和COVID-19患者樣本中的PRRA位點或位點上游缺失變異。他們發(fā)現(xiàn)PRRA缺失的蝙蝠狀冠狀病毒變異體可以在COVID-19患者中自然存在，而且仍然可以傳播，但這些變異在自然感染中的頻率較低，表明它們的競爭性不如插入PRRA的野生型。dPCR對模板進行稀釋和分割，使其能夠更加精準、靈敏捕捉是否存在突變型核酸，適合用于已知的SARS-CoV-2遺傳變異檢測，特別是是對于一些低頻突變。8.抗SARS-CoV-2新藥的評價：在抗病毒藥物的研發(fā)過程中，病毒載量的變化是評估藥物有效性的重要指標。例如，在remdesivir針對成人重癥COVID-19患者的一項研究中，Wang等人32對受試者的呼吸道樣本的病毒載量進行檢測以明確藥物是否能夠加快病毒載量下降或降低病毒檢出率；在arbidol和lopinavir/ritonavir治療藥物的比較研究中，Zhu等人33通過病毒載量的變化來評價藥物的效果。這兩個研究都使用RT-qPCR來測量病毒載量的變化，其中Wang等人通過標準曲線確定病毒載量，Zhu等人僅使用Ct值來表現(xiàn)病毒載量的變化。由于dPCR能夠實現(xiàn)不依賴標準曲線的絕對定量，而且能夠檢測到拷貝數的微小差異，筆者團隊輔助多家藥廠采用dPCR進行新冠新藥的臨床評價（尚未發(fā)表），認為dPCR比RT-qPCR更適合用于評價抗SARS-CoV-2藥物的有效性，能夠給出更具說服力和準確的評價結果。
dPCR將核酸模板稀釋、分配到大量獨立的微反應單元中進行擴增反應，不僅可以對樣本進行絕對定量，針對低豐度的樣本，還能提供更加靈敏和特異的性能，對擴增抑制劑的抗性更強。本文綜述了dPCR在COVID-19疫情監(jiān)測、防控和臨床治療等過程中的應用，如低拷貝病毒樣本檢測、臨床樣本病毒載量定量、參考品標定、環(huán)境中病毒濃度定量、病毒突變檢測等，這些應用也恰恰是其絕對定量、靈敏度、特異性高等優(yōu)勢的體現(xiàn)。雖然dPCR的優(yōu)勢與臨床應用前景已在許多研究中得到確認，但想要進一步在臨床廣泛應用，甚至在各級醫(yī)療單位包括疫區(qū)與基層醫(yī)院推廣使用，dPCR仍面臨一些挑戰(zhàn)。首先是dPCR的動態(tài)范圍受限于離散液滴數的限制需進一步提高，通常能做到的上限一般在106量級。其次，商用dPCR系統(tǒng)目前的檢測通量仍然有限，無法充分滿足COVID-19普篩的需求，需要進一步提升樣本檢測通量。再者，dPCR的臨床實驗室標準仍不成熟，需要制定國家或行業(yè)統(tǒng)一標準，推出商品化的質控品；最后是dPCR設備成本較高，目前可選擇的商用dPCR平臺有限，并且推出的臨床可用的試劑盒數量較少，這些都需要行業(yè)的共同推進和努力。總之，隨著研究和行業(yè)的持續(xù)深入，未來dPCR在實驗室或醫(yī)院中的應用前景，非常值得我們共同期待。致謝：感謝北京市科學技術委員會科技計劃（Z201100005420025 ）和清華大學春風基金滾動支持課題（2020Z99CFG010）對本研究的基金支持。本研究成果發(fā)表于《View》期刊2021年第2期（Applications of digital PCR in COVID-19 pandemic: https://doing.org/10.1002/VIW.20200082），感謝《View》編輯部許可將英文原稿翻譯成中文并根據研究進展更新后發(fā)表于本期刊。
注：本文來源于《臨床實驗室》雜志2021年第5期“分子診斷”專題
