本文轉(zhuǎn)載自檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床雜志
10月11日，發(fā)表在美國(guó)臨床化學(xué)協(xié)會(huì)《臨床化學(xué)》雜志上的一項(xiàng)新研究強(qiáng)化了AACC的建議，即不要使用周期閾值（Ct值）來(lái)確定SARS-CoV-2 PCR檢測(cè)的性能。
今年早些時(shí)候，AACC發(fā)表了一份公開(kāi)聲明，建議在管理 COVID-19 患者時(shí)不要在 PCR 檢測(cè)中使用 Ct 值。它指出，定量檢測(cè)的驗(yàn)證更為復(fù)雜，需要更嚴(yán)格的測(cè)試來(lái)確保性能，例如確定量化的下限，而不是檢測(cè)的下限。
這項(xiàng)由LGC英國(guó)國(guó)家測(cè)量實(shí)驗(yàn)室的研究人員領(lǐng)導(dǎo)的獨(dú)立研究，調(diào)查了在英國(guó)、比利時(shí)和韓國(guó)的三個(gè)實(shí)驗(yàn)室用PCR對(duì)6000多名接受SARS-CoV-2檢測(cè)的患者。研究小組利用世界衛(wèi)生組織建議的Ct截止25作為測(cè)試結(jié)果，發(fā)現(xiàn)臨床敏感度從100%下降到16%到90%之間，這取決于患者群體。研究人員查看了另外732個(gè)實(shí)驗(yàn)室，發(fā)現(xiàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的不同，單個(gè)Ct值可以對(duì)應(yīng)不同的病毒載量。該小組的負(fù)責(zé)人吉姆·哈格特（Jim Huggett）在一份聲明中說(shuō)，雖然Ct值可能有助于流行病學(xué)評(píng)估，但"應(yīng)該避免將這些值作為衡量個(gè)人患者分層或...分析性能目標(biāo)。他說(shuō)："如果要進(jìn)行量化，就應(yīng)該探索根據(jù)適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)的校準(zhǔn)品來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在COVID-19大流行期間，許多RT-PCR檢測(cè)被FDA授權(quán)用于緊急使用，或作為實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的新冠核酸定性檢測(cè)試劑（LDT）進(jìn)行驗(yàn)證。然而，美國(guó)一些衛(wèi)生保健提供者和公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)要求實(shí)驗(yàn)室報(bào)告數(shù)字CT值以及標(biāo)本檢測(cè)到新冠核酸時(shí)的定量結(jié)果。
根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）， CT 值是 "擴(kuò)增儀器在背景之上可檢測(cè)所需的周期數(shù)"。換句話說(shuō)，CT 值是放大目標(biāo)序列的熒光探頭信號(hào)＞用戶驗(yàn)證期間確定的最小檢測(cè)級(jí)別的最低 PCR 周期數(shù)。較低的 CT 值與測(cè)試樣本中目標(biāo)病毒序列（復(fù)制號(hào)）的較高數(shù)量相關(guān)。
根據(jù)統(tǒng)一術(shù)語(yǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)，CLSI 和 ISO 15189 指定了三個(gè)檢測(cè)階段：分析前、分析中和分析后。影響三個(gè)階段中每個(gè)階段 CT 值的因素如下表。
分析前
導(dǎo)致 CT 值變化的各種分析前環(huán)節(jié)，包括患者準(zhǔn)備、生物差異、標(biāo)本類型以及運(yùn)輸和儲(chǔ)存（表 1）。
表1.影響分析前CT值的因素 |
|---|
| 因素 | 解釋 |
|---|
| 患者準(zhǔn)備 | 在前鼻孔、中葉或鼻咽收集之前不去除多余的粘液，或在吃完食物之后未做漱口，都可能導(dǎo)致CT不準(zhǔn)確的結(jié)果。 |
| 暴露和標(biāo)本采集之間的時(shí)間 | 如果采集標(biāo)本太早（例如暴露后前 3 天內(nèi)）或太晚（例如癥狀發(fā)生后 ＞7 天），則可以得出假陰性結(jié)果。 |
| 標(biāo)本收集有效率 | 不規(guī)范的標(biāo)本采集可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確 |
| 生物差異 | 左右鼻孔、一天中的時(shí)間、患者年齡和生物地理祖先 （BGA） 之間的差異也會(huì)影響結(jié)果 |
媒介
| 結(jié)果可能因介質(zhì)而異（例如干拭子、PBS、病毒運(yùn)輸介質(zhì)、通用運(yùn)輸介質(zhì)） |
| 標(biāo)本類型 | 結(jié)果可能因標(biāo)本來(lái)源、取樣部位而異（例如鼻拭子、咽拭子、唾液、痰等） |
| 運(yùn)輸和儲(chǔ)存 | 運(yùn)輸條件和溫度可能會(huì)影響結(jié)果 |
| 標(biāo)本年齡 | 應(yīng)定義標(biāo)本穩(wěn)定性。如果收集和測(cè)試之間的時(shí)間超過(guò)穩(wěn)定窗口，結(jié)果可能不準(zhǔn)確 |
分析中
影響實(shí)際檢測(cè)期間 CT 值的因素包括提取效率、熒光探針選擇和試劑批次差異（表 2）。
表2. 影響分析中CT值的因素 |
|---|
| 因素 | 解釋 |
|---|
核酸回收效率 （非萃取方法） | 缺乏濃縮能力，潛在的抑制和基質(zhì)效應(yīng)會(huì)影響結(jié)果 |
核酸提取效率 （提取方法） | 不同程度的萃取效率和基質(zhì)效應(yīng)會(huì)影響結(jié)果 |
| 抑制檢測(cè) | 沒(méi)有可用的對(duì)照來(lái)檢測(cè)檢測(cè)抑制可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果或假高CT值 |
基因目標(biāo) （多個(gè)與單個(gè)） | CT值可能因基因靶點(diǎn)及其不同的放大動(dòng)力學(xué)而不同，導(dǎo)致相同或不同標(biāo)本的結(jié)果差異 |
| 熒光檢測(cè)設(shè)計(jì) | 用不同熒光團(tuán)標(biāo)記同一基因靶點(diǎn)的探針將增加結(jié)果的可變性 |
| 變異的影響 | 引物/探針的結(jié)合可能會(huì)受到變異的影響，導(dǎo)致CT值的改變 |
| 定義周期閾值 | 根據(jù)CT閾值的定義(例如，使用固定于CT值的校準(zhǔn)器)或閾值的計(jì)算(例如，手動(dòng)vs.自動(dòng)化)，可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和陰性結(jié)果。 |
| 認(rèn)證參考物質(zhì) | 缺乏認(rèn)證的參考物質(zhì)，如校準(zhǔn)器，使得確認(rèn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和驗(yàn)證作為定量LDT的分析具有挑戰(zhàn)性 |
| CT值的平臺(tái)差異 | 平臺(tái)有不同的敏感性和截止值。沒(méi)有建立國(guó)際單位。因此，結(jié)果無(wú)法跨平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)化 |
| CT值范圍可靠性 | 由于缺乏準(zhǔn)確性，不應(yīng)報(bào)告線性范圍以外的CT值 |
| 試劑批間差 | CT值可能因試劑批次而異。除非新試劑批次是用校準(zhǔn)過(guò)的或先前描述過(guò)的材料來(lái)驗(yàn)證的，否則變化的程度是未知的 |
| 人員和操作誤差 | 結(jié)果可能會(huì)因操作人員和一天中的時(shí)間而不同，特別是手動(dòng)方法 |
分析后
在分析后的過(guò)程中，除檢測(cè)靶標(biāo)、可報(bào)告單位和檢測(cè)目標(biāo)等因素外，CT值還會(huì)傳遞給醫(yī)療保健提供者(表3）。
表3.影響 檢查后CT值的因素 |
|---|
| 因素 | 解釋 |
|---|
| 檢測(cè)目的 | CT值的解釋和使用取決于檢測(cè)目的，如篩查、監(jiān)測(cè)、診斷、監(jiān)測(cè)、復(fù)工、術(shù)前、出院管理、傳染性等 |
| 檢測(cè)順序 | 不鼓勵(lì)用不同的基于pcr的檢測(cè)方法縱向監(jiān)測(cè)給定的患者，因?yàn)榉治鲋g的可變性 |
| 傳染性與病毒檢測(cè) | 病毒檢測(cè)不等于傳染性。表明感染病毒的CT值范圍需要通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)研究確定。 |
| 患者具體因素 | 免疫和/或接種疫苗情況可能會(huì)影響CT值的效用 |
| 可報(bào)告單位 | CT(周期數(shù))、ng/uL、TCID50/mL、基因組拷貝數(shù)/mL、RNA NAAT檢測(cè)單位(NDU)/mL之間缺乏相關(guān)性，可能使結(jié)果解釋復(fù)雜化 |
| 手動(dòng)操作 | 手工方法更容易出現(xiàn)錯(cuò)誤(例如，數(shù)據(jù)輸入錯(cuò)誤)，特別是在沒(méi)有遵循質(zhì)量步驟的情況下 |
| 趨勢(shì) | 對(duì)于意外變化(即CT相對(duì)于其他測(cè)量值的顯著變化)缺乏LIS或質(zhì)量標(biāo)志可能會(huì)影響結(jié)果 |
| 再感染/復(fù)發(fā) | 可能發(fā)生相同或不同變異的繼發(fā)性感染，CT值的解釋尚不清楚 |
| 檢測(cè)目標(biāo) | PCR-靶標(biāo)丟失/靶標(biāo)序列變異的初始和重復(fù)試驗(yàn)可能不一致 |
如果實(shí)驗(yàn)室必須報(bào)告CT值需注意
AACC承認(rèn)實(shí)驗(yàn)室在CT值方面處于一個(gè)尷尬的位置。正如本文所總結(jié)的，報(bào)告CT值有許多局限性。雖然實(shí)驗(yàn)室意識(shí)到這些局限性，但也可能有來(lái)自臨床同事的壓力，要求報(bào)告或至少獲得CT值。
對(duì)于決定報(bào)告CT值的實(shí)驗(yàn)室，AACC建議包括下面的解釋性內(nèi)容，以減少與報(bào)告CT值相關(guān)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。AACC建議將這一意見(jiàn)附加到結(jié)果中，并在實(shí)驗(yàn)室報(bào)告中突出顯示。實(shí)驗(yàn)室可能還需要考慮分析的特定CT范圍，假設(shè)精度可接受，提供半定量結(jié)果(例如，低、中、高病毒RNA)和/或基于校準(zhǔn)儀的delta計(jì)算CT值。不鼓勵(lì)使用CT值來(lái)指導(dǎo)患者管理，對(duì)于新冠病毒定性檢測(cè)，尚未確定病毒載量與傳染性的相關(guān)性。生物差異、樣品充足性、接觸時(shí)間、儀器、方法學(xué)、認(rèn)證參考物質(zhì)的缺乏以及監(jiān)管因素等諸多因素都會(huì)影響新冠病毒定性檢測(cè)中檢測(cè)到的CT值。因此，AACC不鼓勵(lì)報(bào)告或披露CT值以指導(dǎo)患者管理。
相關(guān)點(diǎn)評(píng)：
1.實(shí)時(shí)熒光PCR是定性方法
CT值因?yàn)橛袛?shù)值把原本半定量（就是定性）的實(shí)時(shí)熒光PCR方法包裝成了定量的方法，但是定量方法的建立與驗(yàn)證比定性方法的建立與驗(yàn)證更加嚴(yán)格和復(fù)雜，參見(jiàn)GB/T27417-2017 合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)及驗(yàn)證指南。目前實(shí)時(shí)熒光PCR方法的建立和驗(yàn)證都是參照定性方法的參數(shù)。
2.CT值不具有可比性
相同條件下同一次實(shí)驗(yàn)的2個(gè)樣本的CT值具有比較的意義。但是，CT值可以受到引物探針設(shè)計(jì)、熒光基團(tuán)、擴(kuò)增效率、反應(yīng)體系、儀器平臺(tái)、軟件優(yōu)化等一系列因素影響，導(dǎo)致CT值無(wú)法作為一個(gè)恒定的量值進(jìn)行相互比較。另外，只有在實(shí)時(shí)熒光PCR方法的有效線性范圍內(nèi)CT15-35，CT值才比較穩(wěn)定，CT值大于35受到泊松分布概率的影響，CT值呈現(xiàn)一定的隨機(jī)性。
- CLSI: Harmonized Terminology Database. Accessed March 30, 2021. https://htd.clsi.org/listterms.asp?searchdterm=reproducibility&button=Submit
- Ginzinger DG. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp Hematol. 2002;30(6):503-512. doi:10.1016/S0301-472X(02)00806-8
- Is there variability in Ct values? doi:10.1093/cid/ciaa1199
- IDSA and AMP Joint Statement on the Use of SARS-CoV-2 PCR Cycle Threshold (Ct) Values for Clinical Decision-Making.
- First WHO International Standard for SARS-CoV-2 RNA. Accessed April 22, 2021. https://www.nibsc.org/products/brm_product_catalogue/detail_page.aspx?catid=20/146
- Binnicker MJ. Challenges and controversies to testing for COVID-19. J Clin Microbiol. 2020;58(11). doi:10.1128/JCM.01695-20
來(lái)源：IVD從業(yè)者網(wǎng)
點(diǎn)評(píng)內(nèi)容轉(zhuǎn)自原博士帶你做檢測(cè)
