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本文轉(zhuǎn)載自肖亮博 陳光煉 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 作者 | 肖亮博 陳光煉 單位 | 廣州開發(fā)區(qū)醫(yī)院檢驗(yàn)科 自新型冠狀病毒肺炎疫情以來，由于生活、工作、出行等的需要，核酸檢測(cè)、PCR基因檢測(cè)技術(shù)等醫(yī)療專業(yè)名詞，逐漸被醫(yī)療行業(yè)以外的人群所熟知。 對(duì)于我們檢驗(yàn)人而言，由于疫情的緣故，需要檢驗(yàn)人投入到分子檢測(cè)的工作中去，因此涌現(xiàn)出來大批的PCR技術(shù)檢測(cè)人員，盡管如此，當(dāng)有散發(fā)的疫情爆發(fā)時(shí)，依然無法滿足需求，這就會(huì)導(dǎo)致工作人員的平均工作量增加，從而會(huì)遇到各種各樣的問題。 在工作中遇到的各種各樣的，千奇百怪的問題，就是提升自己的各種磨練，這樣才能不斷增長自己的見識(shí)。在這里，筆者想與同道們分享我在實(shí)驗(yàn)室工作過程中，遇到的一些關(guān)于PCR擴(kuò)增曲線的異常情況，如有描述或者解釋不當(dāng)之處，敬請(qǐng)各位同仁不吝賜教。 我們首先簡(jiǎn)單了解下什么是PCR？ PCR，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）的簡(jiǎn)稱，是一種體外模擬天然DNA/RNA復(fù)制的核酸擴(kuò)增技術(shù)，它利用變性-退火-延伸三個(gè)基本步驟，重復(fù)一定的循環(huán)次數(shù)之后，就能將我們需要的目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。 在日常工作中，我們檢驗(yàn)人員需要做的就是對(duì)標(biāo)本進(jìn)行提取、擴(kuò)增。
也可以是圖2這樣的（左側(cè)為對(duì)數(shù)曲線，右側(cè)為原始曲線）
雖然不同儀器及不同判讀界面會(huì)有不同形式的曲線圖，但是原理都是一樣的，都是根據(jù)圖形的基線、閾值線進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的判讀如圖3。
看完上面的正常圖形后，我們下面進(jìn)入正題。 標(biāo)本包括內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)不出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線。 標(biāo)本采集時(shí)是否有采到樣；進(jìn)行核酸提取時(shí)是否漏加或是因?yàn)樵噭﹩栴}提取不成功。 重新采樣檢測(cè)或是重新進(jìn)行核酸提取。 PCR兩個(gè)靶基因的擴(kuò)增曲線呈斜直線型。
出現(xiàn)此種情況可以注意下檢測(cè)完的反應(yīng)管里面該孔位的標(biāo)本是否出現(xiàn)反應(yīng)液面明顯低于其他反應(yīng)孔位的液面，大多數(shù)是由于在分裝試劑時(shí)分液不準(zhǔn)確造成，或是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)所采用的PCR反應(yīng)管氣密性較差，在反應(yīng)的過程中出現(xiàn)了溶液的蒸發(fā)引起探針濃度增加，導(dǎo)致曲線呈斜直線上升。 試劑分液時(shí)應(yīng)注意液面是否在同一水平線上，上機(jī)檢測(cè)前應(yīng)將PCR反應(yīng)管用力蓋嚴(yán)，并仔細(xì)檢查有無縫隙。 從圖形可見，某標(biāo)本三條擴(kuò)增曲線在第7—11循環(huán)之間呈現(xiàn)一個(gè)急劇上升的信號(hào)飆升的現(xiàn)象，隨后三條曲線像是什么都沒發(fā)生一樣又按著“正�！钡能壽E繼續(xù)擴(kuò)增，結(jié)果由于曲線打折后與閾值線相切的緣故，得出“強(qiáng)陽性”的結(jié)果。 由于整板其他孔位曲線沒有異常情況出現(xiàn)，懷疑可能該孔位溶液有氣泡影響：氣泡可以讓光路發(fā)生折射，因此在氣泡破掉的時(shí)候會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)發(fā)生急劇的變化，干擾儀器對(duì)熒光信號(hào)的采集。 檢驗(yàn)操作人員在進(jìn)行核酸提取加樣時(shí)應(yīng)注意，避免大的氣泡的產(chǎn)生；上機(jī)檢測(cè)前觀察溶液是否有氣泡的出現(xiàn)，有的話盡量彈掉后再離心上機(jī)。 基線不平滑，整體擴(kuò)增信號(hào)雜亂，感覺整個(gè)擴(kuò)增效果有點(diǎn)被抑制的情況。 從整體來看整板擴(kuò)增效果不是特別理想，然而進(jìn)行樣本單獨(dú)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)問題僅出現(xiàn)在幾個(gè)標(biāo)本身上，這幾個(gè)標(biāo)本很多都是處于同一條八聯(lián)管，拋開這幾條有問題的八聯(lián)管進(jìn)行分析時(shí)其余結(jié)果未見異常曲線。 受影響的標(biāo)本進(jìn)行復(fù)查，結(jié)果正常；建議采用質(zhì)量好的耗材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 熒光信號(hào)異常，信號(hào)從高到低，波動(dòng)異常。 實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)雖然全部八聯(lián)管的蓋子仍然是蓋嚴(yán)狀態(tài)，但是有些管子里面的液體明顯有所揮發(fā)，出現(xiàn)異常曲線的標(biāo)本液體明顯少于其他標(biāo)本。 受影響的標(biāo)本進(jìn)行復(fù)查，結(jié)果正常；建議采用質(zhì)量好的耗材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 擴(kuò)增曲線在前幾個(gè)循環(huán)出現(xiàn)了信號(hào)明顯波動(dòng)情況，然后趨向于穩(wěn)定。 前期的PCR過程中，由于試劑和核酸樣本沒有得到充分的混勻，導(dǎo)致信號(hào)的不穩(wěn)定，等反應(yīng)了幾個(gè)循環(huán)之后，樣本和反應(yīng)液開始混勻之后，熒光信號(hào)就變得穩(wěn)定。 擴(kuò)增前確保反應(yīng)管是否進(jìn)行混勻之后再離心，如果沒有充分的混勻，樣本體積占比越大的體系越容易發(fā)生這種現(xiàn)象。 熒光信號(hào)出現(xiàn)負(fù)增長。 這種現(xiàn)象是因?yàn)榛�設(shè)置不合理所造成的，一般都是因?yàn)檎宄霈F(xiàn)較多DNA濃度偏高的樣本，而基線的終點(diǎn)設(shè)置大于這些CT值，導(dǎo)致軟件出現(xiàn)計(jì)算錯(cuò)誤。 可以減少基線終點(diǎn)到CT值的前3個(gè)循環(huán)數(shù)，如果不能明確基線起始和終點(diǎn)位置的時(shí)候可以先嘗試進(jìn)行自動(dòng)基線的分析，結(jié)果分析合理的話可以使用自動(dòng)基線的設(shè)置。 實(shí)驗(yàn)做得越多，我們所接觸的異常曲線圖形的幾率就會(huì)越多，而這些圖形都不會(huì)是一成不變的，如何掌握這些異常的曲線分析，是我們檢驗(yàn)人以后要努力學(xué)習(xí)的方向。 |
