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ELISA法廣泛用于乙肝兩對半檢測。但ELISA測定中影響因素較多，有時可見到一些假陽性或假陰性,本文就ELISA測定乙肝兩對半的影響因素及對策做如下討論:
1.1 標本嚴溶血及混有紅細胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶樣的活性，催化底物顯色造成假陽性，嚴重溶血標本禁用。
1.2 采血試管洗滌不徹底、反復(fù)使用易交叉污染；塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。最好使用一次性玻璃試管或真空管采血管；并使用非抗凝標本，肝素抗凝血漿會增加OD值，可能與高濃度肝素具有強大的負電荷能吸附酶標記物不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性。
1.3 標本凝固不全 ，正常血液采集后1/2~2h開始凝固，18~24h完全血塊完全收縮。在工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；因此血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當?shù)拇倌齽?br style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box; font-size: 16px; letter-spacing: 0.544px; overflow-wrap: break-word !important;"/>
2.1 乙肝兩對半試劑廠家較多；不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，資料顯示，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為89.4%—99.3%,78~89%存在較大差異。有的廠家酶標板孔間A值差大于15%；標記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定比較差。使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽性或假陰性。因此。選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準確的關(guān)鍵之一。
2.2 不同方法學(xué)的檢測試劑，會使兩對半結(jié)果出現(xiàn)一些不同。例如：在實際工作中常用ELISA檢測HBsAg結(jié)果為陰性，而電化學(xué)發(fā)光檢測為陽性。除方法學(xué)的靈敏度外；還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別。單抗對變異抗原或亞型乙肝標志物檢測存在差異，建議試劑廠家對劑的制備應(yīng)該考慮亞型及型濃度的問題。
3.1 加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準確性，直接影響檢測結(jié)果。由于吸嘴構(gòu)造特殊，導(dǎo)致清洗困難，加大了交叉污染的機會。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準。
3.2 溫浴影響，96孔酶標板結(jié)構(gòu)特別；易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對溫度有嚴格要求，酶標板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。
3.3 冼滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié)，手冼條件一致性較差，對結(jié)果影響較大，半自動與全自動冼板機使用不當也會影響結(jié)果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機針小孔全阻塞或半阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標記酶洗脫不徹底，導(dǎo)致“花板”造成假陽性或假陰性；所以操作洗板機過程中要不時觀察洗板機針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，及時糾正，洗板機不用時應(yīng)用去離子水清冼幾遍。
3.4 肉眼判斷結(jié)果時，顯色淺不易觀察，影響結(jié)果的準確性，必須使用酶標儀檢測，以保結(jié)果一致性。
隨著ELISA一步法的應(yīng)用，一些標本中抗原含量過高，產(chǎn)生HooK效應(yīng)。影響檢測結(jié)果，采用同步稀釋測定或使用線性范圍高的兩對半定量法可以減HooK反應(yīng)的發(fā)生。
有人認為大約40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。
如RF因子可與標記二抗的FC段法結(jié)合造成假陽性，補體從 C1q 活化，使一抗和酶標二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu)，F(xiàn)c 的 C1q 分子結(jié)合點暴露出來，則補體 C1q 可將二者連接起來造成假陽性，采用56℃30分鐘滅活補體可降低假陽性率，高濃度的 AFP（如孕婦），在儲存過程中可能形成二聚體會導(dǎo)致本底過深影響檢測結(jié)果。
6.1 高效價的乙肝免疫球蛋白會與HBsAg形成復(fù)合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測會呈陰性反應(yīng)，導(dǎo)致乙肝兩對半少見模式的出現(xiàn)。
如我們常遇到乙肝大三陽的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播時，在孕第8、9、10月常規(guī)注射200mg 乙肝免疫球蛋白。不僅影響孕婦 HBsAg 的檢出，而且其所生產(chǎn)的生新兒也常出現(xiàn)HBsAg陰性、HBeAg 陽性和HBcAb陽性等少見模式。這可能是乙肝免疫球蛋白屬 IgG 抗體能通過胎盤進入胎兒體內(nèi)與胎兒血液中的 HBsAg 結(jié)合形成復(fù)合物，導(dǎo)致新生兒 HBsAg 檢測呈陰性。用0.5mol/L的鹽酸處理標本1小時可提高出率。
6.2 為預(yù)防乙肝，部分 HBsAg 陰性人群在接種乙肝疫苗后的1—2周內(nèi)，血清中可檢出 HBsAg 成份，形成一過性 HBsAg 陽性，這可能是乙肝疫苗主要成分是 HBsAg.，有方法能夠把它檢出；如電化學(xué)發(fā)光法，建議接種乙肝疫苗后1個月內(nèi)不應(yīng)作 HBsAg 檢測。
總之，乙肝兩對半檢測必須排除各種影響因素的干擾才能為臨床提供正確可靠的檢測結(jié)果。
