本標準按照GB/T 1.1-2020給出的規(guī)定起草。本標準起草單位：江蘇省疾病預防控制中心、中國疾病預防控制中心環(huán)境與健康相關產(chǎn)品安全所、蘇州市疾病預防控制中心。本標準主要起草人：徐燕、吳曉松、郭喜玲、王玲、崔侖標、陳銀、沈瑾、王嵬、褚宏亮、范晶晶、孫惠惠、沈益鳴、遲瑩、李放、楊海兵。
本文件規(guī)定了消毒因子對新型冠狀病毒消毒效果實驗室評價的基本要求、病毒滅活試驗方法、結果評價和注意事項。本文件適用于新型冠狀病毒實驗室消毒效果的檢測與評價。
下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。消毒技術規(guī)范（2002年版）衛(wèi)生部 (衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕282號)
低溫消毒 cryogenic disinfection：對溫度在0℃以下的環(huán)境或物品進行的消毒。低溫消毒需使用在該溫度下被證明有效的消毒因子。
新型冠狀病毒消毒效果試驗應在獲得開展新型冠狀病毒培養(yǎng)實驗活動資格的BSL-3實驗室中進行；從事新型冠狀病毒消毒效果評價的實驗室人員應同時具有病毒學和消毒學實驗室工作經(jīng)驗；進入BSL-3實驗室的人員應經(jīng)過生物安全的培訓和考核，具有BSL-3實驗室的準入資格。4.2.1 實驗室試驗分懸液法病毒滅活試驗和載體法病毒滅活試驗。實驗室試驗以懸液法病毒滅活試驗為主，對不適宜用懸液法病毒滅活試驗評價的消毒劑和器械，如黏稠的消毒劑、原液使用的消毒劑及紫外線等消毒器械的實驗室試驗可用載體法病毒滅活試驗。4.2.2 實驗室懸液病毒滅活試驗時，有機干擾物為牛血清白蛋白。原則上對用于不經(jīng)過清洗或污染的消毒對象的消毒劑，牛血清白蛋白的濃度為 3.0%；對用于經(jīng)過清洗或較清潔的消毒對象的消毒劑，牛血清白蛋白的濃度為 0.3%；對用于經(jīng)過嚴格清洗或極清潔的消毒對象的消毒劑，可不使用有機干擾物。試驗中病毒接觸的溶液、病毒載體等，均應在試驗溫度（20 ℃±1 ℃）平衡后開始試驗。實驗室載體病毒滅活試驗時使用相應滴度的病毒培養(yǎng)液滴染載體后備用。4.2.3 用于評估消毒因子低溫消毒效果時，應做規(guī)定低溫條件下的消毒效果驗證，一般采用載體法進行。試驗時消毒劑和病毒載體應在低溫環(huán)境下平衡不少于 30 min 后進行測試，其余實驗步驟與常溫下（20 ℃±1 ℃）相同。4.2.4 試驗重復 3 次，重復性試驗應分期分批進行。必要的器材和試劑應重新制備或滅菌，以防產(chǎn)生系統(tǒng)性誤差。
試驗病毒為分裝保存并確定病毒滴度的新型冠狀病毒培養(yǎng)物，細胞株為非洲綠猴腎傳代細胞（Vero-E6）或其它適合用于新型冠狀病毒增殖培養(yǎng)的細胞系。消毒因子、中和劑、細胞消化液、細胞維持液和細胞培養(yǎng)液等。二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、冰箱、水浴箱、II 級或 II 級以上生物安全柜等。無菌帶濾芯tip頭、吸管、離心管、凍存管、試管、多孔細胞培養(yǎng)板、單道移液器、多道移液器等。實驗所用Vero- E6細胞或其它細胞在細胞培養(yǎng)室常規(guī)傳代培養(yǎng)，置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng)至單層細胞備用。取出-80 ℃低溫保存的新型冠狀病毒，室溫解凍后，與設定濃度的有機干擾物混合作為消毒劑滅活試驗用病毒懸液。5.4.1 載體應根據(jù)消毒對象選擇相應的材料。常用的材料有布片、玻璃片、不銹鋼片等，金屬載體一般用 12 mm 直徑圓形金屬片（厚 0.5 mm），其他材質載體一般為方形，大小 10 mm×10 mm，特定用途的消毒因子可使用其他相兼容材質的載體。5.4.2 所用載體于染病毒前，應進行脫脂處理。脫脂過程應嚴格按照如下步驟進行：a) 將載體放入含洗滌劑的水中煮沸 30 min;5.4.3 載體經(jīng)壓力蒸汽滅菌后烘干備用，試驗前使用滴染法染病毒懸液。5.4.4 滴染載體的病毒滴度對數(shù)值應≥4.0。鑒定試驗旨在確定所選中和劑是否適用于擬進行的細胞感染法病毒滅活試驗。中和劑鑒定試驗包括預試驗和正式試驗，通過預試驗確定消毒劑、中和產(chǎn)物和中和劑等對細胞生長有無影響；通過所設各組試驗結果綜合分析，確定所用中和劑是否對測試消毒劑有良好的中和作用，對試驗用病毒和細胞株是否有害或不良影響；中和試驗用消毒劑濃度應為正式消毒試驗最高濃度，作用時間最短不得少于30 s。試驗重復3次。在使用細胞感染法進行病毒滅活試驗時，對所用中和劑的鑒定，應進行以下各組預試驗，如果中和劑與中和產(chǎn)物對細胞生長無影響，再進行正式試驗。a) 中和劑+細胞→培養(yǎng)：觀察所用中和劑對細胞的生長有無影響。b) （消毒劑+中和劑）+細胞→培養(yǎng)：觀察中和產(chǎn)物溶液對細胞生長有無影響。c) 消毒劑+細胞→培養(yǎng)：觀察消毒劑對細胞生長有無影響。在確定了中和劑與中和產(chǎn)物對細胞生長無影響后，進行正式試驗。a) 中和劑+病毒懸液/病毒載體→接種細胞培養(yǎng)：觀察中和劑對病毒有無抑制作用。b) （消毒劑/消毒劑載體+中和劑）+病毒懸液/病毒載體→接種細胞培養(yǎng)：觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和的殘留消毒劑對病毒有無抑制作用或對檢測方法有無干擾。c) 病毒懸液/病毒載體→接種細胞培養(yǎng)：觀察病毒是否可致細胞病變，并將該組病毒滴度對數(shù)值作為陽性對照值。d) 未接種病毒的細胞→培養(yǎng)：觀察細胞生長是否正常。a) 第 1 組。試驗體系中按病毒與中和劑（1︰4 體積比例）進行試驗。吸取 0.2 mL 病毒混懸液于試管內，置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，吸取中和劑溶液 0.8 mL，混合均勻。作用 10 min，以細胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養(yǎng)板上，每個滴度接種 4孔。置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。b) 第 2 組。試驗體系中按病毒與中和產(chǎn)物（1︰4 體積比例）進行試驗。吸取 0.2 mL 病毒混懸液于試管內，置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，吸取中和產(chǎn)物溶液 0.8 mL，混合均勻。作用 10 min，以細胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養(yǎng)板上，每個滴度接種4 孔。置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。c) 第 3 組。試驗體系中按病毒與細胞維持液（1:4 體積比例）進行試驗。吸取 0.2 mL 病毒混懸液于試管內，置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，吸取細胞維持液 0.8 mL，混合均勻。作用 10 min，以細胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養(yǎng)板上，每個滴度接種4 孔。置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。d) 第 4 組。將試驗用細胞，加細胞維持液后置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng)。a) 第 1 組。將病毒載體置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，浸入中和劑 1.0 mL，作用 10 min。充分洗脫，以細胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養(yǎng)板上，每個滴度接種 4 孔。置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。b) 第 2 組。將病毒載體置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，浸入中和產(chǎn)物溶液(染有消毒劑的載體+中和劑,作用 10 min)1.0 mL，混合均勻。充分洗脫，以細胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100μL，接種于單層細胞培養(yǎng)板上，每個滴度接種 4 孔。置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。c) 第 3 組。將病毒載體置 20 ℃±1 ℃中 5 min 后，浸入細胞維持液 1.0 mL，充分洗脫，以細胞維持液作 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養(yǎng)板上，每個滴度接種 4 孔。置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng) 3-4 天。d) 第 4 組。將試驗用細胞，加細胞維持液后置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃,5%±1%二氧化碳）中培養(yǎng)。c) 中和劑和中和產(chǎn)物，在正式試驗的最高濃度下對細胞生長無影響；用細胞感染法測定消毒因子作用前后（或對照組與實驗組）樣本中病毒的量。以細胞病變作為判斷指標，確定各組病毒的感染滴度，觀察消毒因子對新型冠狀病毒的滅活效果。a) 取待測消毒劑，用滅菌硬水稀釋至所需濃度的 1.25 倍，于 20 ℃±1 ℃水浴中備用。b) 病毒懸液的制備：取出-80 ℃低溫保存的新型冠狀病毒，室溫解凍后，與有機干擾物按照 1：1 比例混合作為消毒劑滅活試驗用病毒懸液。c) 消毒試驗：取上述病毒懸液 1 份加入 4 份待檢消毒劑，立即混勻并記時。作用至規(guī)定時間，立即取出 0.1 mL，加入經(jīng)鑒定合格的 0.9 mL 中和劑中混勻；或用經(jīng)鑒定合格的除藥方法處理。d) 對照組試驗：陽性對照組為病毒對照組，觀察病毒生長是否良好，病毒滴度是否達到試驗要求；陰性對照組用細胞維持液作為陰性對照，觀察有無污染，細胞生長是否良好。e) 以上各組按照終點稀釋法分別進行病毒滴度測定。試驗重復 3 次。f) 終點稀釋法：用細胞維持液對待滴定樣本做 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養(yǎng)板上，每個滴度接種 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培養(yǎng)板，更換細胞維持液。繼續(xù)放入二氧化碳培養(yǎng)箱中（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）培養(yǎng) 3-4 天，顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，記錄細胞病變情況。b) 陽性對照組病毒滴度對數(shù)值應≥5.0；c) 消毒試驗組細胞無病變，與陰性對照組細胞生長情況一致。a) 取待測消毒劑，置于 20 ℃±1 ℃水浴中備用。b) 病毒載體的制備：取滅菌載體片，滴染新型冠狀病毒晾干備用。c) 消毒試驗：取病毒載體置于消毒因子，作用至規(guī)定的時間后取出放入經(jīng)鑒定合格的中和劑或洗脫液 1.0 mL 中，作用 10 min,混勻洗脫。消毒器械載體布點應置于最難殺滅部位，具體方法參照《消毒技術規(guī)范》。d) 對照組試驗：陽性對照組為病毒對照組，觀察病毒生長是否良好，病毒滴度是否達到試驗要求；陰性對照組用細胞維持液作為陰性對照，觀察有無污染，細胞生長是否良好。e) 以上各組按照終點稀釋法分別進行病毒滴度測定。試驗重復 3 次。f) 終點稀釋法：用細胞維持液對待滴定樣本做 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細胞培養(yǎng)板上，每個滴度接種 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培養(yǎng)板，更換細胞維持液。繼續(xù)二氧化碳培養(yǎng)箱中（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）培養(yǎng) 3-4 天，顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，記錄細胞病變情況。b) 陽性對照組病毒滴度對數(shù)值應≥4.0；c) 消毒試驗組細胞無病變，與陰性對照組細胞生長情況一致。
同時符合下列a)和b)的消毒因子判為消毒效果合格：b) 懸液滅活試驗，每次試驗對新型冠狀病毒應有效滅活，陽性對照組病毒滴度對數(shù)值應≥5.0 或載體滅活試驗，每次試驗對新型冠狀病毒應有效滅活，陽性對照組病毒滴度對數(shù)值應≥4.0。
7.1 實驗人員應嚴格按照 BSL-3 實驗室個人防護標準操作規(guī)程要求做好個人防護。建議參與實驗的人員進行新型冠狀病毒疫苗接種。7.2 涉及新型冠狀病毒活病毒的操作應嚴格執(zhí)行 BSL-3 實驗室的生物安全相關規(guī)定。7.3 無菌器材使用前需檢查包裝是否完整，有破損者不得使用。7.4 消毒試驗所用的細胞培養(yǎng)基和試劑等均需無菌。
7.5 實驗活動涉及新型冠狀病毒活病毒的操作，應在 BSL-3 實驗室的生物安全柜中進行，實驗過程中若發(fā)生溢灑等意外情況時，應嚴格按照 BSL-3 實驗室意外情況應急處置操作規(guī)程等進行安全處置。7.6 實驗廢棄物應按照相應廢棄物處置操作規(guī)程進行安全處置。來源：國家衛(wèi)生健康委員會網(wǎng)站
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